晏云濤，趙　汝，苗淑淑，高　洪，俸江琴

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201)

在我國(guó)，大腸埃希菌(Escherichiacoli)已確定為耐藥性檢測(cè)的指示菌株，可引起人畜共患病，其主要特點(diǎn)是有多血清型、多抗原性、能引起全身性臨床癥狀和病理變化，又由于家畜的年齡、免疫力、病毒攜帶因子和感染途徑有所差異[1]，就使得所產(chǎn)生的病理變化和主要癥狀不同，主要可引發(fā)敗血癥、腹膜炎、卵黃囊炎、仔豬黃痢、仔豬白痢、豬水腫病等[2-3]，對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)、食品加工、水質(zhì)環(huán)境造成嚴(yán)重危害和污染[4]。由于大腸埃希菌缺乏有效的疫苗，使得大腸桿菌病一直都依靠藥物進(jìn)行控制。目前獸醫(yī)臨床治療大腸桿菌病的常見(jiàn)藥物有β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)等[5]。由于大腸桿菌病的用藥可選擇范圍大、用藥不規(guī)范等種種原因?qū)е铝舜竽c埃希菌的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，并且逐漸成為人類(lèi)健康的潛在威脅之一，而且耐藥基因介導(dǎo)的耐藥菌株正逐步趨向于多重耐藥，因此對(duì)其耐藥性的檢測(cè)顯得尤為迫切[6]。

氨基糖苷類(lèi)藥物是一類(lèi)作用于細(xì)菌核糖體，進(jìn)而使細(xì)菌蛋白質(zhì)合成受阻來(lái)迫使細(xì)菌死亡的抗菌藥物[7],由于氨基糖苷類(lèi)藥物廣譜抗菌、效果顯著、廉價(jià)、藥代動(dòng)力學(xué)特征良好，特別是對(duì)需氧型革蘭陰性菌的感染有良好的治療作用，因此被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床[8]。隨著這類(lèi)藥物的廣泛應(yīng)用尤其是濫用，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生也在逐年增加[9]。研究表明，革蘭陰性菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥機(jī)制主要為其攜帶aac、ant(aad)、aph基因，它們分別編碼N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、O-核苷轉(zhuǎn)移酶(O-腺苷轉(zhuǎn)移酶)、O-磷酸轉(zhuǎn)移酶等氨基糖苷類(lèi)修飾酶，致氨基糖苷類(lèi)藥物被修飾從而失去生物活性，這是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的最主要機(jī)制[10-12]。本研究旨在探討云南省楚雄州某豬場(chǎng)撒壩豬大腸埃希菌對(duì)6種氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥性以及耐藥基因aadA1和aph(3′)的攜帶情況，為獸醫(yī)臨床合理使用此類(lèi)抗生素提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1試驗(yàn)菌株從云南楚雄州某豬場(chǎng)有腹瀉癥狀的撒壩豬的糞便中，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的51株大腸埃希菌。

1.1.2主要試劑LB培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；藥敏試紙片，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000 、核酸染料、2×Real Star Green Power Mixture，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1細(xì)菌的純化培養(yǎng)將保存于-80℃的51株大腸埃希菌在無(wú)菌環(huán)境下接種到事先高壓滅菌過(guò)且制備好的LB固體培養(yǎng)基上和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，倒置于37℃恒溫箱培養(yǎng)12 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.2藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)和判斷標(biāo)準(zhǔn),依照美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)所推薦的抗菌藥物敏感試驗(yàn)紙片法[13]，選用鏈霉素、新霉素、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素6種氨基糖苷類(lèi)藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2.3大腸埃希菌DNA的提取挑取單個(gè)菌落接種到6 mL的LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中37℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜；將培養(yǎng)好的51株大腸埃希菌菌液用移液槍分別吸取1.5 mL到離心管內(nèi)，12 000 r/min離心1 min,棄上清;按照百泰克細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，最后將提取出來(lái)的DNA保存在-20℃冰箱備用。

1.2.4PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[14-15]的引物，在NCBI上對(duì)編號(hào)為13905339和4364198進(jìn)行查找，并利用Primer6設(shè)計(jì)引物( 表1 ),引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增體系共25 μL：2×Real Star Green Power Mixture 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL，底物模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃ 30 s,aadA1 60℃ 30 s(aph(3′)55℃ 30 s)，72℃ 1min,共32個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，置-4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)讀取結(jié)果。

表1　引物核酸序列

2　結(jié)果

2.1　大腸埃希菌的純化鑒定

37℃培養(yǎng)12 h后，在LB瓊脂平板上形成的菌落形態(tài)為小凸起的圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明的菌落，直徑約為2 mm～3 mm (圖1A)；最典型的是在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，形成深紫黑色、光滑、濕潤(rùn)、帶有金屬光澤的圓形菌落(圖1B)[16]，可判定為大腸埃希菌。

A.LB瓊脂;B.伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基

A.LB agar media;B.Eosinosilan plate tablet

圖1菌落形態(tài)

Fig.1Colonial morphology

2.2　大腸埃希菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1耐藥率實(shí)驗(yàn)室保存的51株豬源致病性大腸埃希菌的耐藥結(jié)果顯示，E.coli對(duì)6種氨基糖苷類(lèi)抗生素都表現(xiàn)出了不同程度的耐藥性，其中卡那霉素的耐藥率最高達(dá)到70.6%，其次是鏈霉素49.0%、妥布霉素47.1%、慶大霉素43.1%、新霉素35.3%，耐藥率最低的是阿米卡星15.7% (表2)。

2.2.2多重耐藥率51株大腸埃希菌對(duì)6種氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥率顯示，無(wú)耐藥菌株21.6%(11株)，單耐藥菌株3.9%(2株)，雙耐藥菌株27.5%(14株)，三耐藥菌株15.7%(8株)，四耐藥菌株9.8%(5株)，五耐藥菌株9.8%(5株)，六耐藥菌株11.8%(6株)，其中以雙耐藥菌株所占比例最多。

表2　51株大腸埃希菌耐藥結(jié)果

2.3　aadA1和aph(3′)基因的檢測(cè)結(jié)果

2.3.1aadA1耐藥基因檢測(cè)結(jié)果以51株大腸埃希菌DNA作為模板，以aadA1作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳對(duì)aadA1耐藥基因攜帶情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，在51株大腸埃希菌分離菌株中，有28株大腸埃希菌的aadA1基因片段擴(kuò)增出陽(yáng)性，其陽(yáng)性檢出率為54.90%(圖2)。

2.3.2aph(3′)耐藥基因檢測(cè)結(jié)果以51株大腸埃希菌DNA作為模板，以aph(3′)作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳對(duì)aph(3′)耐藥基因攜帶情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，在51株大腸埃希菌分離菌株中，有44株大腸埃希菌的aph(3′)基因片段擴(kuò)增出陽(yáng)性，其陽(yáng)性檢出率為86.27%(圖3)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～51.大腸埃希菌分離株;N.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1-51.Isolate ofE.coli;N.Negative control

圖251株大腸埃希菌分離株aadA1基因擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.2Amplification products of aadA1 gene of 51E.coliisolates

3　討論

在短短數(shù)十年之間，高度抗生素選擇性壓力使動(dòng)物源性的耐藥菌的耐藥特點(diǎn)從最初的單一耐藥、耐藥率低、傳播速度緩慢，到如今變?yōu)槟退幾V寬、耐藥率高、耐藥性傳播速度快的局面[17]。從大量耐藥性檢測(cè)報(bào)告可看出，近年來(lái)豬源性E.coli耐藥性有增長(zhǎng)趨勢(shì)，且多重耐藥問(wèn)題嚴(yán)重[18-19]。

根據(jù)薛原等[20]對(duì)黑龍江省分離的60株致病性大腸埃希菌對(duì)6種抗生素耐藥性的檢測(cè)，其藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)卡那霉素耐藥率達(dá)73%。本次藥敏試驗(yàn)對(duì)卡那霉素耐藥率70.6%，結(jié)果與其一致。畢保良等[21]研究了2012年云南省某規(guī)模化豬場(chǎng)大腸埃希菌多重耐藥性，結(jié)果顯示多重耐藥菌株占分離株的70%。本次藥敏試驗(yàn)51株撒壩豬大腸埃希菌多重耐藥率高達(dá)74.6%，結(jié)果與其近似，提示云南楚雄州某豬場(chǎng)撒壩豬大腸埃希菌耐藥性普遍存在，且多重耐藥率有上升的趨勢(shì)，為豬場(chǎng)建立防控措施提供了可靠的依據(jù)。矯薇薇等[22]研究了2015年江西豬源大腸埃希菌耐藥性，結(jié)果大腸埃希菌對(duì)慶大霉素的耐藥率高達(dá)97.1%，而本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)慶大霉素耐藥率僅為43.1%。張俊豐等[23]等分析92株豬腹瀉大腸埃希菌耐藥性，結(jié)果大腸埃希菌對(duì)慶大霉素、新霉素、鏈霉素的耐藥率均高于50%，對(duì)阿米卡星的耐藥率在20%以上，本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示撒壩豬大腸埃希菌對(duì)慶大霉素、新霉素、鏈霉素、阿米卡星的耐藥率分別為41.3%、35.3%、49.0%和15.7%，與上述報(bào)道存在差異，這可能是撒壩豬與普通商品豬對(duì)大腸埃希菌的易感性和耐藥性方面存在差異，也可能與豬的年齡、性別和地域相關(guān)。通過(guò)本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果可看出，同一種藥物對(duì)各個(gè)菌株的敏感性不同，而同一菌株對(duì)各種藥物的敏感性差異就更加顯著，所以臨床用藥前必須做好藥敏試驗(yàn)，以便篩選出對(duì)大腸埃希菌敏感的藥物。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～51.大腸埃希菌分離株;N.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1-51.Isolates ofE.coli;N.Negative control

圖351株大腸埃希菌分離株aph(3′)基因擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.3Amplification products of aph(3′) gene of 51E.coliisolates

根據(jù)湯景元等[24]調(diào)查，我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)大腸埃希菌氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥基因的流行情況，結(jié)果檢測(cè)到aadA1、aacC2、aacC4、aphA3共4種基因型，其中以aadA1檢出率最高，超過(guò)50%。陳琳等[25]對(duì)豬腸道氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥基因分析結(jié)果顯示，aac(3)-Ⅱ檢出率最高(93.5%)，其次為aph(3′)(超過(guò)70%)。根據(jù)本次PCR結(jié)果顯示，aadA1和aph(3′)的陽(yáng)性檢出率分別為54.90%和84.67%，PCR結(jié)果與上述文獻(xiàn)基本吻合，提示云南省某豬場(chǎng)豬源性大腸埃希菌中aadA1和aph(3′)基因的流行率較高，均超過(guò)50%，這一流行率普遍與國(guó)內(nèi)其他養(yǎng)殖場(chǎng)豬源性E.coli中aadA1和aph(3′)基因的流行率相似，說(shuō)明豬源性E.coli對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥水平在不斷提高，豬場(chǎng)應(yīng)該針對(duì)性用藥，采用多種抗生素交叉或聯(lián)合使用，按照相關(guān)規(guī)定合理使用抗生素，以提高療效，降低毒性，延緩和避免抗藥性產(chǎn)生。