許運斌，孫玉章，劉　娟，顏　焰，高興紅，羅　果，王　歡

(1.遵義醫(yī)學院貴州省普通高等學校傳染病與生物安全特色重點實驗室，貴州遵義 563000；2.青島蔚藍生物股份有限公司/國家動物用保健品工程技術研究中心,山東青島 266000；3.浙江大學農(nóng)業(yè)部動物病毒學重點實驗室，浙江杭州 310058)

狂犬病病毒(Rabies virus，RV)磷蛋白(phosphoprotein，P)是一種由297個氨基酸(aa)組成的磷酸化蛋白，它的磷酸化通過兩種細胞蛋白激酶進行，其N端S63或S64位點的磷酸化由細胞內(nèi)未被完全鑒定的RV蛋白激酶(Rabies virus protein kinase，RVPK)負責，該位點的磷酸化作用尚不清楚；蛋白激酶PKC(protein kinase C)則負責對其C端S162、S210和S271的3個位點進行磷酸化，有研究發(fā)現(xiàn)這3個位點的磷酸化與否可影響P蛋白的核質(zhì)分布[1-2]。RV P蛋白全長是P 基因mRNA的主要產(chǎn)物，除此之外，P蛋白還有其他4種截短形式(P2：aa 20-297；P3：aa 53-297；P4：aa 69-297； P5：aa 83-297)[3]。P蛋白全長定位于細胞質(zhì)，而缺失核輸出信號序列(nuclear export sequence，NES)的P蛋白截短體P3則定位于核仁并與核仁蛋白發(fā)生相互作用，如此有利于RV感染的正常進行[1,4-6]。隨后有研究采用病毒反向遺傳操作技術發(fā)現(xiàn)RV P蛋白的不同截短體在RV神經(jīng)侵染能力、復制能力以及拮抗干擾素能力等方面均發(fā)揮著重要的作用[7]。

熱休克蛋白90AA1(heat shock protein 90AA1，Hsp90AA1)是真核細胞中表達量最為豐富和保守的一種重要的分子伴侶蛋白[8-9]。與其他眾所周知的分子伴侶Hsp70和GroEL/ES蛋白不同的是，Hsp90并不參與大部分蛋白的初始折疊，而是有選擇地促進其客戶蛋白的最后成熟[10]。Hsp90的客戶蛋白包括蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子,如p53和甾體類激素受體(steroid hormone receptors，SHRs)以及各種病原體蛋白[11-14]。因此，Hsp90蛋白不僅在蛋白折疊中發(fā)揮著功能，而且在各種宿主細胞生理進程(包括信號轉(zhuǎn)導、胞內(nèi)運輸和蛋白降解)和病毒感染中起著重要的作用。

最近,本實驗室研究發(fā)現(xiàn),Hsp90AA1通過與RV P蛋白相互作用使之處于穩(wěn)定狀態(tài)進而正調(diào)控RV的感染[15]，而Hsp90AA1是否能夠識別RV P蛋白截短體及磷酸化位點突變體尚不清楚。本研究在真核表達情況下對Hsp90AA1與RV P蛋白截短體及其磷酸化位點突變體的相互作用進行免疫共沉淀分析，以獲得對RV P蛋白截短體及其磷酸化位點突變體在RV感染過程中作用方式的新認識，有助于解析RV復雜的復制機理，為狂犬病的有效防控提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1細胞培養(yǎng)鼠神經(jīng)瘤母細胞(Mouse neuroblastoma N2a cells，N2a)培養(yǎng)于含50 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。N2a細胞鋪至6孔板，待細胞密度培養(yǎng)至80%左右時進行相關質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染48 h后收獲細胞總蛋白樣品。

1.1.2抗體Flag標簽鼠單抗，Sigma公司產(chǎn)品；Myc標簽兔多抗，杭州華安生物技術有限公司產(chǎn)品；GFP標簽鼠單抗，Abcam公司產(chǎn)品；HRP標記的羊抗鼠IgG和HRP標記的羊抗兔IgG，KPL公司產(chǎn)品。

1.1.3主要試劑PCMV-N-Myc、PCMV-N-Flag和PEGFP-C3，Clotech公司產(chǎn)品；Ex FectTM轉(zhuǎn)染試劑，Vazyme公司產(chǎn)品。含1×苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)的Western及IP裂解液，上海碧云天生物技術有限公司產(chǎn)品；Protein A/G，Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1真核表達載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染小鼠全長的Hsp90AA1基因通過PCR從N2a細胞cDNA中獲得，然后克隆至PCMV-N-Myc。全長的P蛋白基因通過PCR從RV毒株HEP-Flury cDNA中獲得，然后分別克隆至PCMV-N-Flag和PEGFP-C3，分別命名為Flag-P和GFP-P。根據(jù)RV P蛋白在宿主細胞內(nèi)的截短形式，通過PCR從RV毒株HEP-Flury cDNA中獲得P2、P3、P4和P5多種截短形式的基因片段，然后克隆至PCMV-N-Flag，分別命名為Flag-P2、Flag-P3、Flag-P4和Flag-P5。根據(jù)RV P蛋白磷酸化位點的具體位置，在PEGFP-C3-P載體的基礎上構(gòu)建S64、S162、S210和S271單一位點或所有位點突變(S→A)的真核表達載體，分別命名為GFP-P、GFP-P64、GFP-P162、GFP-P210、GFP-P271和GFP-P多突(所有位點突變體)。真核表達載體的轉(zhuǎn)染采用ExFectTM轉(zhuǎn)染試劑，具體操作步驟參考該轉(zhuǎn)染試劑說明書。相關載體構(gòu)建的特異性引物見表1。

表1　載體構(gòu)建引物序列

1.2.2免疫共沉淀轉(zhuǎn)染后的細胞首先用預冷的1×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液漂洗2次，之后采用含1×苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)的Western及IP裂解液于4℃過夜進行裂解。裂解后的細胞蛋白樣品4℃、12 000 r/min離心10 min,去除非溶解的細胞碎片。離心后的蛋白上清部分采用Protein A/G瓊脂糖珠于4℃預處理30 min。之后5 000 r/min離心3 min,去除預處理用的瓊脂糖珠。預處理后的蛋白上清部分與IP用的抗體于4℃過夜進行孵育。接著加入新鮮的Protein A/G 瓊脂糖珠于4℃孵育6 h。之后采用離心和1×PBS緩沖液洗滌法收集Protein A/G瓊脂糖珠。瓊脂糖珠上結(jié)合的蛋白復合物通過加入SDS 4×蛋白上樣緩沖液煮沸洗脫。最后洗脫后的蛋白用于免疫印跡分析。

2　結(jié)果

2.1　Hsp90AA1與RV P蛋白多種截短體的相互作用

采用Flag-P、Flag-P2、Flag-P3、Flag-P4和Flag-P5和Myc-Hsp90AA1共6種真核表達質(zhì)粒進行以下試驗。Myc-Hsp90AA1與Flag-P、Flag-P2、Flag-P3、Flag-P4或Flag-P5共轉(zhuǎn)染于293T細胞之后，采用Flag鼠單抗進行免疫共沉淀；被沉淀出來的免疫復合物采用Flag鼠單抗和Myc兔多抗進行免疫印跡分析。結(jié)果顯示，Hsp90AA1能夠與RV P蛋白的多種截短體發(fā)生相互作用(圖1)。由此可知，Hsp90AA1能夠廣泛識別RV P蛋白各種截短體，對于該蛋白各種截短體的穩(wěn)定可能都起著重要作用。

2.2　Hsp90AA1與RV P蛋白多種磷酸化位點突變體的相互作用

采用GFP-P、GFP-P64、GFP-P162、GFP-P210、GFP-P271和GFP-P多突和Myc-Hsp90AA1六種真核表達質(zhì)粒進行以下試驗。Myc-Hsp90AA1與GFP-P、GFP-P64、GFP-P162、GFP-P210、GFP-P271或GFP-P多突共轉(zhuǎn)染于293T細胞之后，采用GFP鼠單抗進行免疫共沉淀；被沉淀出來的免疫復合物采用GFP鼠單抗和Myc兔多抗進行免疫印跡分析。結(jié)果顯示，Hsp90AA1能夠與RV P蛋白的不同磷酸化位點突變體發(fā)生相互作用(圖2)。由此指示，Hsp90AA1也可廣泛識別RV P蛋白的不同磷酸化位點突變體，對于不同RV P蛋白磷酸化位點突變體的穩(wěn)定也可能都起著重要作用。

A.免疫共沉淀分析Hsp90AA1與RV P蛋白多種截短突變體的相互作用；B.對A中的Myc和Flag融合蛋白水平采用Image J軟件進行相對定量分析

A.Immunoprecipitation analysis of the interaction between Hsp90AA1 and truncated mutants of Rabies virus phosphoprotein;B.Comparative quantitative analysis of Myc and Flag fusion proteins described in A using Image J software

圖1Hsp90AA1與RV P蛋白多種截短體相互作用的分析

Fig.1Analysis of the interaction between Hsp90AA1 and truncated mutants of Rabies virus phosphoprotein

3　討論

狂犬病病毒是一種單股負鏈不分節(jié)段的RNA囊膜病毒，其基因組長度為11 928 nt～11 932 nt。該病毒基因組可編碼核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依賴的RNA聚合酶(L)等5種結(jié)構(gòu)蛋白。其中P蛋白作為聚合酶L蛋白無催化活性的輔助因子，在RV RNA合成中起著重要的作用。該蛋白與N蛋白和RV基因組形成蛋白核酸復合物，進而調(diào)節(jié)L蛋白參與病毒的轉(zhuǎn)錄與復制。P蛋白也能夠與許多宿主細胞蛋白相互作用，進而經(jīng)不同方式執(zhí)行利于病毒復制的功能。有研究表明，P蛋白與動力輕鏈8蛋白(dynein light chain 8，LC8)的相互作用對于RV的致病性相當重要，而且P蛋白中LC8的結(jié)合區(qū)域可有效地促進病毒的轉(zhuǎn)錄[16-18]。P蛋白作為干擾素拮抗因子與激活的STAT相關蛋白相互作用可對抗JAK-STAT信號通路的激活[19-20]。此外，P蛋白能夠阻斷IRF3的磷酸化進而抑制干擾素的產(chǎn)生[21]。有研究發(fā)現(xiàn)黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)能夠通過與P蛋白相互作用正調(diào)控RV的復制[22]。近期研究發(fā)現(xiàn),不同截短形式的RV P蛋白通過其干擾素拮抗活性促進肌肉細胞中的病毒復制，從而支持病毒對外周神經(jīng)的感染[7]。本實驗室在之前的研究中證明了Hsp90AA1能夠通過穩(wěn)定P蛋白進而正調(diào)控RV的復制。而本研究發(fā)現(xiàn)Hsp90AA1能夠廣泛識別天然存在的不同截短形式的RV P蛋白。由此暗示，Hsp90AA1可能通過相互作用來穩(wěn)定P蛋白不同截短體，然后經(jīng)不同途徑發(fā)揮正調(diào)控RV復制的作用，這有待更為深入的研究。

A.免疫共沉淀分析Hsp90AA1與RV P蛋白多種磷酸化突變體的相互作用；B.對A中的Myc和GFP融合蛋白水平采用Image J軟件進行相對定量分析

A.Immunoprecipitation analysis of the interaction between Hsp90AA1 and phosphorylated mutants of Rabies virus phosphoprotein;B.Comparative quantitative analysis of Myc and GFP fusion proteins described in A using Image J software

圖2Hsp90AA1與RV P蛋白多種磷酸化位點突變體相互作用的分析

Fig.2Analysis of the interaction between Hsp90AA1 and phosphorylated mutants of Rabies virus phosphoprotein

RV P蛋白的磷酸化位點主要有N端的S63或S64位點，以及C端的S162、S210和S271位點[23]。RV不同毒株P蛋白N端區(qū)域磷酸化位點不盡相同，這些位點的磷酸化對于該蛋白的二聚化沒有影響，其功能還有許多不確定性[24]。P蛋白C端區(qū)域的磷酸化，尤其是S210位點的磷酸化似乎可調(diào)控P蛋白的核質(zhì)分布，在阻斷細胞先天性免疫反應方面起著重要的作用[1]。本研究發(fā)現(xiàn)P蛋白不同位點磷酸化突變體均能與Hsp90AA1發(fā)生相互作用，但不同磷酸化位點突變之后(S→A)與Hsp90AA1相互作用的能力在減弱。其中的原由可能是磷酸化位點的磷酸化與否,對于P蛋白空間構(gòu)象的形成至關重要，而Hsp90AA1作為伴侶蛋白對不同空間構(gòu)象的P蛋白識別能力有差別。

總而言之，本研究通過構(gòu)建RV P蛋白不同截短形式和不同磷酸化位點突變形式的真核表達載體，經(jīng)免疫共沉淀初步證明Hsp90AA1能夠廣泛識別其截短體及磷酸化位點突變體。這些發(fā)現(xiàn)有助于解析RV P蛋白不同截短體和磷酸化位點突變體的功能乃至病毒的復制機制，為狂犬病有效防控奠定基礎。