汪　偉，孫文超，曹　亮，易馳喆，鄭　敏，魯會(huì)軍*，金寧一*

(1.軍事獸醫(yī)研究所，吉林長(zhǎng)春 130122；2.溫州大學(xué)病毒學(xué)研究所，浙江溫州 325035；3.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001)

犬圓環(huán)病毒(Canine circovirus，CanineCV)在分類學(xué)上屬于環(huán)狀病毒科(Circoviridae)環(huán)狀病毒屬(Circovirus)的成員，為無(wú)囊膜的單股環(huán)狀DNA 病毒，基因組的大小約為2063 bp。CaineCV基因組包括兩個(gè)主要的編碼框，分別編碼復(fù)制酶(Rep)蛋白和核衣殼(Cap)蛋白。CaineCV于2012年首次被報(bào)道后[1]，陸續(xù)在意大利和德國(guó)發(fā)現(xiàn)[2]。已有病例報(bào)道稱CaineCV是引起犬淋巴結(jié)肉芽腫和壞死性血管炎的致病因子，臨床癥狀主要表現(xiàn)為嘔吐、出血性腹瀉等[2]。目前，歐美各國(guó)均已經(jīng)對(duì)CaineCV開展相關(guān)研究，而我國(guó)對(duì)該病毒的研究比較滯后。2016年孫文超等[3-4]對(duì)我國(guó)CaineCV的流行狀況進(jìn)行了首次報(bào)道。CanineCV 的ORF1編碼框全長(zhǎng)912 bp，編碼由303個(gè)氨基酸組成的復(fù)制酶(Rep蛋白)，Rep蛋白主要參與病毒的復(fù)制，但對(duì)其功能和作用機(jī)制尚不明確。為了對(duì)CaineCV 的Rep蛋白進(jìn)行深入研究，本研究以犬圓環(huán)病毒基因組為模板序列，設(shè)計(jì)了特異性引物，通過(guò)PCR 擴(kuò)增出Rep基因的完整序列，連接至pET-28a載體上，通過(guò)大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Rep蛋白，為制備Rep蛋白的亞單位疫苗和建立CanineCV的ELISA 檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

大腸埃希菌BL21、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，2×TaqPCR MasterMix，TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、瓊脂糖、氨芐青霉素、卡那霉素等，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD18-T載體，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；CanineCV JZ98/2014毒株、pET-28a質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)保存。

1.2　方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)以GenBank中收錄的CanineCV JZ98/2014毒株序列(登錄號(hào)：KT946839)為參考序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Rep基因的特異性引物。上游引物F(BamHⅠ)：5′-GCGGGATCCATGGCTCAAGCTCAGGTTGA-3′；下游引物R(XhoI)：5′- CCCTCGAGGTAGTTATACATGAAAGGGAAC -3′，目的片段大小為912 bp，引物序列由吉林庫(kù)美生物有限公司合成。

1.2.2基因組樣品的制備參照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說(shuō)明書提取病毒基因組。

1.2.3PCR反應(yīng)及基因克隆以提取的基因組樣品為模板進(jìn)行PCR 。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，回收純化后連入pMD18-T載體，4℃ 連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃ 搖床培養(yǎng)45 min 后，涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)13 h。從平板上挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，少量提取質(zhì)粒后用XhoⅠ和BamHⅠ酶切鑒定，酶切結(jié)果正確樣品送吉林庫(kù)美生物有限公司測(cè)序。

1.2.4原核表達(dá)載體的構(gòu)建將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒及pET-28a原核表達(dá)載體分別經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物，4℃ 連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有卡那霉素的LB 平板上培養(yǎng)13 h。從平板上挑取單菌落至含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，少量搖菌后小提，質(zhì)粒雙酶切鑒定后送吉林庫(kù)美生物有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET(28a)-Rep。

1.2.5重組蛋白的原核表達(dá)將pET(28a)-Rep 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)14 h 。從平板上挑取單菌落至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)12 h，保存至4℃冰箱作為母液備用。將母液按1∶500的比例接種到新鮮培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD 600 nm值在0.4～0.8之間，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后收取樣品。樣品加入buffer沸水浴5 min，SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色鑒定誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.6Wstern blot鑒定誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE 電泳后，凝膠通過(guò)半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含50 mL/L小牛血清的脫脂乳封閉2 h后，加入鼠源Anti-His標(biāo)簽抗體孵育2 h后TBST洗3次，加入HPR 標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育2 h后TBST洗3次，AEC顯色。

2　結(jié)果

2.1　Rep基因的PCR擴(kuò)增

以CanineCV基因組作為模板，PCR擴(kuò)增出Rep基因的全長(zhǎng)序列，條帶大小約為900 bp，與預(yù)期相符。將目的條帶連接在pMD18-T載體上后送測(cè)序，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為T-Rep (圖1)。

2.2　重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將T-Rep質(zhì)粒以及pET-28a載體分別經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，瓊脂糖電泳鑒定正確。膠回收純化后4℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。將菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上，培養(yǎng)12 h后挑菌。挑取單菌落用液體LB培養(yǎng)12 h后小提，雙酶切鑒定為陽(yáng)性。測(cè)序結(jié)果顯示目的基因已正確連接在pET-28a載體上，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET(28a)-Rep(圖2)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.基因組樣品；2.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1.Genomic sample;2.Nagetive control

圖1Rep基因的PCR擴(kuò)增

Fig.1PCR amplification of Rep gene

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.質(zhì)粒

M.DNA Marker DL 2 000;1.Plasmids

圖2pET(28a)-Rep質(zhì)粒雙酶切鑒定

Fig.2Idetification of pET(28a)-Rep plasmids by double enzyme digestion

2.3　原核表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

在轉(zhuǎn)有重組質(zhì)粒pET(28a)-Rep的大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中加入終濃度0.5 mmol/L IPTG，置于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，7 h后取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將菌液超聲裂解，取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析鑒定，通過(guò)與空載體和0 h的誘導(dǎo)產(chǎn)物對(duì)比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有pET(28a)-Rep質(zhì)粒的重組菌能正確表達(dá)帶有His標(biāo)簽的Rep蛋白，條帶大小約為35 ku，與預(yù)期相符。重組蛋白主要集中在沉淀中，表明重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)(圖3)。

2.4　原核表達(dá)產(chǎn)物的Wstern blot鑒定

在SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，用Anti-His標(biāo)簽抗體檢測(cè)帶有His標(biāo)簽的重組Rep蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果表明重組菌的表達(dá)產(chǎn)物能與Anti-His標(biāo)簽抗體發(fā)生特異性結(jié)合，表明帶有His標(biāo)簽的重組Rep蛋白得到正確表達(dá)(圖4)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pET-28a誘導(dǎo)前產(chǎn)物； 2.pET-28a誘導(dǎo)后產(chǎn)物；3.重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物沉淀； 4.重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物上清

M.Protein molecular weight Marker;1.pET-28a pre-induced products;2.pET-28a induced products;3.Precipitate of the recombinant bacteria induced products;4.Supernatant of the recombinant bacteria induced products

圖3重組Rep蛋白表達(dá)形式分析

Fig.3SDS-PAGE analysis of recombinant Rep proteins

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pET-28a誘導(dǎo)前產(chǎn)物；2.pET-28a誘導(dǎo)后產(chǎn)物；3.重組菌誘導(dǎo)前產(chǎn)物；4.重組菌誘導(dǎo)后產(chǎn)物

M.Protein molecular weight Marker;1.pET-28a pre-induced products;2.pET-28a induced products;3.Recombinant bacteria pre-induced products;4.Recombinant bacteria induced products

圖4重組Rep蛋白Western blot鑒定

Fig.4Identification of recombinant Rep protein by Western blot

3　討論

自2012年Kapoor等首次報(bào)道犬圓環(huán)病毒以來(lái)，歐美各國(guó)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了CanineCV并開展了相關(guān)研究，而我國(guó)一直未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。直到2016年，孫文超等人首次從犬血清中樣品檢測(cè)出CanineCV病毒，遺傳進(jìn)化分析表明我國(guó)發(fā)現(xiàn)的CanineCV毒株與歐美各國(guó)發(fā)現(xiàn)的毒株位于不同的進(jìn)化分支。Li L等[5]從感染犬細(xì)小病毒的病犬糞便樣品中用RT-qPCR方法成功檢測(cè)到CanineCV病毒，進(jìn)一步研究表明感染CanineCV可引起病犬淋巴肉芽腫、壞死性血管炎以及出血性腹瀉等臨床癥狀，但目前尚無(wú)直接證據(jù)表明CanineCV能獨(dú)立引發(fā)上述臨床癥狀。Decaro N等[2]通過(guò)病理學(xué)剖檢和電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，CanineCV與圓環(huán)病毒屬的其他成員相似，均以淋巴細(xì)胞為主要侵害細(xì)胞[6]。已報(bào)道的CanineCV的基因組長(zhǎng)度均為2 063 bp，包含有3個(gè)閱讀框，其中含有912 bp 堿基最大的閱讀框ORF1編碼病毒的Rep蛋白，其分子量大小約為33 ku，目前的研究表明，Rep蛋白主要與病毒的復(fù)制有關(guān)，但Rep蛋白的具體功能和作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

已有研究表明Rep蛋白較為保守，通過(guò)對(duì)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)Rep蛋白的功能的分析，可作為研究CanineCV Rep蛋白功能及作用機(jī)制的參考。在PCV2上的研究表明Rep蛋白是由PCV2基因組的最大編碼框ORF1 編碼，在病毒轉(zhuǎn)錄過(guò)程中ORF1轉(zhuǎn)錄本mRNA第417-799 nt 處發(fā)生了剪接，產(chǎn)生了一個(gè)截?cái)嗟腞ep' 蛋白，兩者在病毒的復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同作用[7-8]。兩種蛋白的N端序列中含有與CanineCV 滾環(huán)復(fù)制相關(guān)的3個(gè)保守序列Ⅰ(FTLUI)、Ⅱ(HLQG)、Ⅲ(YCSK) 以及1個(gè)結(jié)合dNTPs的P環(huán)結(jié)構(gòu)，這些序列的缺失或突變均會(huì)影響病毒的增殖。Cheung A K等[9-10]研究表明Rep和Rep'與細(xì)胞核中的dsDNA復(fù)制原點(diǎn)結(jié)合后， 使其頸環(huán)結(jié)構(gòu)展開，暴露出九聚體序列，隨后Rep/Rep'識(shí)別并切割該序列，以滾環(huán)方式進(jìn)行基因組復(fù)制。對(duì)PCV2 Rep啟動(dòng)子區(qū)類干擾素刺激反應(yīng)元件(vISRE)進(jìn)行點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)突變株增殖能力相對(duì)親本株大幅度下降和對(duì)干擾素刺激的反應(yīng)，這表明Rep啟動(dòng)區(qū)域vISRE可能在干擾素促進(jìn)病毒增殖過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[11]。張?chǎng)蝃12]通過(guò)構(gòu)建Cap蛋白和Rep蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)共轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)Cap蛋白和Rep蛋白存在共定位現(xiàn)象，推測(cè)Rep蛋白與Cap蛋白在病毒復(fù)制過(guò)程發(fā)揮協(xié)同用。目前在PCV2上的研究表明，PCV2感染后可以誘導(dǎo)Cap蛋白和Rep蛋白的產(chǎn)生，其中Cap蛋白包含主要的抗原中和表位，具有良好的免疫原性，但是存在體外表達(dá)難度大、表達(dá)量低的缺點(diǎn)，其次針對(duì)PCV2的疫苗產(chǎn)生的抗體主要針對(duì)Cap蛋白，不利于臨床檢測(cè)區(qū)分疫苗免疫與自然感染之間的鑒別診斷問(wèn)題?，F(xiàn)有的研究表明Rep蛋白也可以誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，且可以在體外高效表達(dá)。Rep蛋白的這些特點(diǎn)有利于研制針對(duì)Rep蛋白的亞單位疫苗和ELISA檢測(cè)試劑盒[13-14]。

自2012年首次報(bào)道CanineCV后，歐美各國(guó)已逐步開展對(duì)CanineCV的研究，然而至今對(duì)其臨床癥狀、病理特征、致病機(jī)制及檢測(cè)手段尚無(wú)明確報(bào)道。本試驗(yàn)以CanineCV基因組為模板，成功擴(kuò)增出病毒的Rep蛋白序列，并將其連接在pET-28a載體上，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET(28a)-Rep。SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果表明帶有His標(biāo)簽的重組Rep蛋白能以包涵體的形式在重組菌中獲得高效表達(dá)。該重組蛋白可用于制備Rep蛋白的抗體，為制備CanineCV的ELISA檢測(cè)試劑盒及CanineCV的防控奠定了基礎(chǔ)。