張志強，楊　楠，李永慧，王洪彬，吳同壘，康元環(huán)，莘　余，史秋梅，高桂生，王春鳳*

(1.河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室/河北科技師范學院，河北秦皇島 066004；2.秦皇島第二醫(yī)院，河北昌黎 066600；3.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春 130118)

遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda)在水產(chǎn)養(yǎng)殖上危害嚴重，魚類感染該菌后病死率高、易反復、免疫力低下，傳統(tǒng)抗生素和化學藥物療效不確切，急需開發(fā)新型、高效、安全的防治方法[1-2]。疫苗使用在畜禽生產(chǎn)上的巨大成功給水產(chǎn)養(yǎng)殖提供諸多借鑒，多種水產(chǎn)疫苗被開發(fā)應用，展現(xiàn)良好前景。遺憾的是，目前遲緩愛德華菌疫苗的研制還遠未滿足生產(chǎn)需求。除此之外，遲緩愛德華菌可以引起人的多種類型感染[1]，近年來通過食源途徑感染的報道不斷增多，說明了本菌在公共衛(wèi)生學方面的重要性[3]。

鞭毛蛋白是細菌鞭毛的主要結構蛋白之一，在細菌運動、黏附和侵染宿主過程中發(fā)揮重要作用[4]，是細菌的重要毒力因子[5]。研究發(fā)現(xiàn)，細菌鞭毛蛋白能夠活化宿主免疫反應，起到疫苗佐劑的作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)，鞭毛蛋白可以通過TLR5通路誘導炎癥反應發(fā)生并促使樹突狀細胞成熟，該蛋白無論是與抗原混合還是融合表達，均表現(xiàn)出良好的免疫效果[6-7]。除此之外，鞭毛蛋白本身具有較強的免疫原性，具有一定的免疫保護力[5]。FliC是構成鞭毛絲的主要蛋白成分，是目前鞭毛研究的焦點蛋白，其生物學功能得到一定程度解析[8]。本研究以遲緩愛德華菌鞭毛蛋白FliC作為研究對象，用原核表達方法獲得大量純化的FliC重組蛋白，并進一步用動物試驗評估該重組蛋白的免疫原性和對于模型動物的保護力，為進一步研制遲緩愛德華菌亞單位疫苗和核酸疫苗靶點的選擇奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌株、質粒與實驗動物致病性遲緩愛德華菌ET-13分離株由東南大學高大慶教授惠贈；遲緩愛德華菌陽性血清、原核表達載體pET-32a、禽呼腸病毒sigmaC蛋白，由河北科技師范學院動物傳染病研究室保存；6周齡～8周齡清潔級昆明小鼠，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，試驗前自由采食1周，以適應環(huán)境。

1.1.2酶及其他試劑LATaqDNA 聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶及T4連接酶，Thermo公司產(chǎn)品；His標簽單克隆抗體(His-MAb)、HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體(HRP-IgG)、IPTG及Ni+argose填料，康維世紀公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigma公司產(chǎn)品；大腸埃希菌DH5α、BL21感受態(tài)細胞，全式金公司產(chǎn)品；基因組提取試劑盒、質粒小提試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1fliC基因克隆根據(jù)GenBank上公布的遲緩愛德華菌參考菌株ET-1基因組序列(CP001135.1)設計特異性引物擴增fliC基因。引物P1：5′-ATGGCACAAGTAATTAATACC-3′；引物P2：5′-ACGCAGCAGAGACAGGACG-3′。

用OMEGA基因組提取試劑盒提取fliC基因組，并以其為模板PCR擴增目的基因?；厥漳康幕?，連接PMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉化入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落進行PCR檢測，陽性菌落送由生工生物工程(北京)股份有限公司測序。在GenBank中下載愛德華氏菌參考株及腸桿菌科其他成員菌株目的基因序列，分析目的基因的保守性。

1.2.2重組原核表達載體的構建根據(jù)測序結果設計特異性擴增引物：P3：5′-CGGGATCCATGGCACAAGTAATTAATACC-3′，帶有BamHⅠ酶切位點；P4：5′-GCGTCGACACGCAGCAGAGACAGGACG-3′，帶有SalⅠ酶切位點。

測序結果正確的菌株擴大培養(yǎng)，提取質粒，以pMD18-T-fliC為模板，擴增目的基因并回收。用BamHⅠ和SalⅠ分別對純化目的基因和pET-32a載體進行雙酶切，回收后按照3∶1比例連接，轉入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中。挑取克隆進行PCR驗證，陽性克隆提取質粒進行雙酶切驗證和序列測定，無突變和移碼即得到重組表達載體pET-32a-fliC。

1.2.3His-FliC蛋白的原核表達將重組載體pET-32a-fliC和空載體分別轉化入BL21工程菌中，挑取單菌落接種含有氨芐青霉素(50 μg/L)的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，誘導表達5 h。離心收集菌體沉淀，PBS緩沖液洗滌3次；加入蛋白上樣緩沖液，充分混勻后煮沸10 min，離心，收集上清液即為蛋白樣品，利用SDS-PAGE鑒定；His-MAb為一抗，HRP-IgG為二抗，分別用50 g/L脫脂奶粉按1∶1 000和1∶5 000稀釋，用Western blot方法進一步確認目的蛋白表達。

1.2.4重組蛋白的可溶性分析及純化將表達目的蛋白菌株按照上述條件進行擴大培養(yǎng)，離心收集菌體；用超聲破碎儀破碎菌體，離心分離沉淀、上清，將細菌裂解物、上清以及沉淀分別制備蛋白樣品，SDS-PAGE分析目的蛋白在三部分中的含量。本研究中重組FliC蛋白為部分上清表達，利用Ni2+親和層析方法對上清蛋白進行純化，獲得較高純度的蛋白，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定純化蛋白濃度，于-70℃保存。

1.2.5免疫小鼠血清抗體水平的檢測將40只健康昆明小鼠隨機分成2組，每組20只。以純化的His-FliC蛋白作為免疫原，首免肌肉注射30 μg重組FliC蛋白(弗氏完全佐劑乳化)，間隔2周后二免(弗氏不完全佐劑乳化)，30 d后以弗氏不完全佐劑乳化蛋白加強免疫；對照組小鼠3免疫均注射等體積的PBS(加對應佐劑)。參照文獻[9]小鼠免疫后不同時間點，尾尖采取小鼠血液并分離血清，以純化的重組FliC蛋白作為包被抗原，利用間接ELISA方法檢測小鼠血清中抗體的效價，以陰性血清OD 450 nm平均值加3倍標準差作為陰陽性判定標準。

1.2.6重組FliC蛋白免疫保護試驗于第48天對上述兩組小鼠腹腔接種遲緩愛德華菌ET-13菌液，劑量為5LD50(2.0×107CFU)，感染后觀察4 d，統(tǒng)計死亡數(shù)量。

1.2.7遲緩愛德華菌FliC蛋白作為佐劑效果評估參照文獻方法[10]，將40只健康昆明鼠隨機分成4組，每組10只。以購買的牛血清白蛋白(BSA)作為評估蛋白，設置BSA免疫組、BSA+FliC蛋白免疫組以及BSA+弗氏佐劑免疫組，同時設立PBS組作為對照。免疫途徑為皮下注射，免疫分兩次進行，首免后間隔10 d進行二免，蛋白免疫劑量均為100 μg/只。

BSA蛋白油乳劑免疫組首免加完全福氏佐劑，二免加不完全福氏佐劑進行免疫，空白對照組以PBS替代。各免疫組在免疫后第 0、10、20、30天尾尖采血，進行小鼠血清抗BSA抗體效價檢測。

2　結果

2.1　fliC基因克隆與重組表達載體pET-32a-fliC的構建

用PCR方法擴增出完整的fliC基因，并將其克隆到pMD18-T載體上，由生物公司測序，將測序結果與E.tarda其他菌株fliC基因參考序列比對分析顯示愛德華菌屬成員間fliC基因高度保守。用fliC基因的特異性擴增引物通過PCR方法，獲得大小為1 248 bp的目的片段(圖1)，將目的基因與原核表達載體pET-32a連接構建重組表達載體。

2.2　融合蛋白His-FliC的表達驗證

將重組載體pET-32a-fliC轉至表達工程菌 BL21中誘導表達重組蛋白，收集的菌體制備蛋白樣品，進行SDS-PAGE驗證，如圖2A所示在60 ku處誘導表達出目的蛋白，分別以His-Mab、HRP-IgG為一抗和二抗進行Western blot分析，同樣于60 ku處出現(xiàn)目的條帶(圖2B)，證明His-FliC重組蛋白能夠表達。

M.DNA標準DL 2 000；1.fliC基因M.DNA Marker DL 2 000；1.fliC gene

2.3　His-FliC表達的可溶性分析及純化

將能夠表達目的蛋白的工程菌株擴大培養(yǎng)并誘導表達目的蛋白，收集菌體并對其超聲裂解后在上清和沉淀中檢測到目的蛋白(圖3A)。取誘導表達上清進行純化，在60 ku處純化出His-FliC (圖3B)，測定蛋白濃度為0.36 mg/mL。

2.4　多抗血清識別E.tarda鞭毛FliC蛋白效果驗證

用Western blot分析發(fā)現(xiàn)，E.tarda感染小鼠陽性血清可以特異性識別重組His-FliC蛋白(圖4A)。

將重組蛋白免疫小鼠，并于3免后15 d對所有組小鼠以5 LD50E.tarda活菌進行腹腔攻毒，120 h內(nèi)觀察并記錄每組小鼠的死亡情況。結果顯示，對照組小鼠全部死亡，免疫組小鼠死亡6只，其余小鼠在經(jīng)歷短暫精神沉郁、不食后逐漸恢復健康。圖4B結果表明，His-FliC重組蛋白免疫小鼠后具有一定保護力，保護率為70%。

A.SDS-PAGE分析His-FliC在大腸埃希菌中的表達； B.Western blot分析His-FliC在大腸埃希菌中的表達

M.蛋白分子質量標準;1.pET-32a-FliC/BL21重組菌株; 2.pET-32a/BL21空載體菌株對照

A.SDS-PAGE analysis of His-FliC expression inE.coliBL21;B.Western blot analysis of His-FliC expression inE.coliBL21

M.Protein molecular weight Marker;1.pET-32a-FliC/BL21;2.pET-32a/BL21

圖2His-FliC蛋白原核表達的驗證

Fig.2Confirmation of prokaryotic expression of His-FliC

A.SDS-PAGE分析大腸埃希菌表達His-FliC的可溶性； B.SDS-PAGE分析His-FliC的純化效果

M.蛋白分子質量標準;1.菌體裂解物; 2.菌體裂解物上清;3.菌體裂解物沉淀;4.純化的 His-FliC蛋白

A.SDS-PAGE analysis of soluble His-FliC expression inE.coliBL21;B.SDS-PAGE analysis of His-FliC purification

M.Protein molecular weight Marker;1.Lysate of induced pET-32a-FliC/BL21;2.Supernatant of bacterial lysate;3.Precipitate of bacterial lysate;4.Purified protein His-FliC

圖3His-FliC蛋白的純化

Fig.3Purification of His-FliC

A.Western blot分析陽性血清對His-FliC蛋白的識別；B.His-FliC蛋白對小鼠的免疫保護效果

1.His-FliC重組蛋白;2.禽呼腸病毒His-sigmaC重組蛋白

A.His-FliC recognized by anti-E.tardapolyclonal antibody by Western blot analysis;B.Immune-protective potency of His-FliC in mice

1.His-FliC protein;2.His-sigmaC protein of avian reovirus

圖4His-FliC蛋白對小鼠免疫保護力

Fig.4Immunoprotection of the mice againstE.tarda

2.5　免疫小鼠血清抗體水平的檢測結果

將 FliC免疫小鼠4次采集的血清按1∶100進行稀釋，以500 ng/mL重組蛋白包被酶標板，以羊抗鼠IgG-HRP為二抗進行間接ELISA檢測(圖5A)。結果表明，重組蛋白免疫小鼠能夠產(chǎn)生較高水平特異性抗體，在加強免疫后達到最高水平。

將不同佐劑+BSA免疫小鼠4次采集的血清按1∶100進行稀釋，以500 ng/mL BSA蛋白包被酶標板，以羊抗鼠IgG-HRP 為二抗進行間接 ELISA 檢測(圖5B)。結果表明，單純BSA免疫小鼠幾乎不產(chǎn)生特異性抗體，F(xiàn)liC混合BSA免疫能夠刺激機體產(chǎn)生較高水平BSA的特異性抗體，雖不及弗氏佐劑組抗體水平高，依然證明了遲緩愛德華菌FliC蛋白的佐劑特性。

A.His-FliC免疫小鼠后，抗FliC抗體效價監(jiān)測測；B.不同佐劑免疫下BSA抗體效價監(jiān)測A.The specific antibody levels in mice induced by His-FliC;B.The specific antibody levels in mice induced by BSA with different adjuvant

3　討論

遲緩愛德華菌是一種重要的水產(chǎn)病原菌，廣泛引起多種海水魚類、淡水魚類感染發(fā)病，危害重大，尚無安全高效防控手段[11]。疫苗接種是規(guī)模化養(yǎng)殖防控疫病的重要手段，但目前遲緩愛德華菌疫苗的研究和使用還比較局限[12]。

鞭毛是細菌重要的附屬元件，在細菌運動、黏附宿主細胞及生物被膜形成過程中發(fā)揮重要作用[8]。有研究表明鞭毛蛋白可以參與刺激宿主產(chǎn)生免疫反應過程，兼具免疫保護性和佐劑特性，具有廣泛的應用前景。本研究嘗試對遲緩愛德華菌鞭毛蛋白FliC進行原核表達并進一步對其相關特性進行研究。對鼠傷寒沙門菌研究發(fā)現(xiàn)，其鞭毛蛋白具有良好的免疫原性，可以直接刺激機體強烈的免疫保護反應，是沙門菌的重要保護性抗原。本研究以Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，遲緩愛德華菌感染小鼠血清能夠識別原核表達的鞭毛蛋白FliC蛋白，證明遲緩愛德華菌感染過程中鞭毛蛋白能夠激發(fā)免疫反應，可能是一個保護性抗原。進一步研究發(fā)現(xiàn)，純化的鞭毛蛋白FliC免疫小鼠，能夠刺激機體產(chǎn)生高效價的血清抗體，而攻毒試驗結果表明FliC蛋白可以在一定程度上保護小鼠抵御遲緩愛德華菌感染，揭示遲緩愛德華菌的鞭毛蛋白是重要的保護性抗原。當前，關于鞭毛蛋白研究的熱點是其作為疫苗佐劑的應用。一方面鞭毛蛋白是TLR5受體的配體，可以通過激活NF-κB信號通路調控下游細胞因子表達，活化炎癥反應[6]。另一方面細菌鞭毛蛋白可以促進樹突狀細胞成熟增加抗原的遞呈效率，對機體免疫應答起到增強作用[13]。鞭毛蛋白的佐劑特性已被證實，無論將鞭毛蛋白與其他蛋白混合免疫或是將鞭毛蛋白和其他蛋白融合表達均能起到免疫佐劑效果，鞭毛蛋白的應用前景十分廣闊[10]。本研究用遲緩愛德華菌鞭毛蛋白FliC與牛血清白蛋白BSA混合免疫小鼠，結果顯示，與單純BSA免疫組比較，F(xiàn)liC蛋白混合免疫組小鼠表現(xiàn)出較高BSA血清抗體滴度，證實遲緩愛德華菌FliC蛋白的佐劑特性，而FliC蛋白混合免疫組小鼠血清效價明顯低于弗氏佐劑組，也表明FliC蛋白作為佐劑應用還不夠成熟，還有相當長的路要走。當然，本研究還存在諸多不完善之處，如缺乏對細胞免疫的評估，對FliC蛋白佐劑特性研究只是基于抗體效價檢測，缺乏細胞因子水平檢測、信號通路研究等,對此，本課題組將于未來繼續(xù)完善。本項研究為進一步研制遲緩愛德華菌亞單位苗和活載體疫苗提供了參考。