廖昌韜，曾凡桂，嚴(yán)專強(qiáng)，覃健萍,3，曹永長(zhǎng),3，謝青梅，陳　峰,,3*

(1.廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東新興 527439；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；3.廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東新興 527400)

H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus H9N2 subtype,H9N2 AIV)屬于低致病性毒株，除了造成禽呼吸道疾病和引起蛋雞與種雞的產(chǎn)蛋量下降外[1]，還容易與其他病毒或細(xì)菌發(fā)生共感染，對(duì)生產(chǎn)危害極大。隨著疫苗的持續(xù)使用及養(yǎng)殖環(huán)境的不斷變化，流感病毒的變異也不斷增強(qiáng)，防控難度不斷加大[2]。

近年來(lái)，對(duì)于流感病毒HA位點(diǎn)的變化及其功能改變的研究主要專注于人流感病毒和高致病性AIV。在此之前，針對(duì)H1亞型、H3亞型和H5亞型AIV的HA蛋白糖基化位點(diǎn)功能研究表明，缺失或者增加糖基化位點(diǎn)能夠影響病毒毒力和免疫逃逸功能[3-4]。而根據(jù)現(xiàn)有的報(bào)道和數(shù)據(jù)分析顯示，H9N2亞型AIV的HA蛋白第200位N-糖基化位點(diǎn)存在大量的缺失現(xiàn)象，并且具有范圍增大的趨勢(shì)[5]。因此，本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離純化的H9N2 AIV流行毒株HA蛋白第200位N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建了兩株重組病毒株并進(jìn)行初步的探索。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1病毒株、細(xì)胞、質(zhì)粒及雞胚Influenza A virus H9N2 A/Chicken/Guangdong/WZP12/2013(KT023025.1)，廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，自然缺失第200位N-糖基化位點(diǎn)，縮寫為WZP。大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞與pMD18-T載體，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；雙向表達(dá)質(zhì)粒pHW2000質(zhì)粒、6個(gè)內(nèi)源基因重組表達(dá)質(zhì)粒及293T細(xì)胞，中山大學(xué)曹永長(zhǎng)教授饋贈(zèng)；MDCK細(xì)胞系，本實(shí)驗(yàn)室保存；9日齡～11日齡SPF雞胚，購(gòu)自新興大華農(nóng)禽蛋有限公司。

1.1.2主要試劑Prime Script○ROne Step RT-PCR Kit、pMD18-T載體、DNA Marker DL 2 000、10×Loading Buffer 、EXTaq酶、Premix高保真酶、A-tailing試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；核酸染料EB替代物Goldview、瓊脂糖，寶泰克生物科技有限公司產(chǎn)品；AxyPrep病毒DNA/RNA提取試劑盒、DNA純化/回收試劑盒，愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司產(chǎn)品；BsmBΙ內(nèi)切酶、BsaΙ內(nèi)切酶、T4連接酶、ExTaq酶，NEB(北京)有限公司產(chǎn)品；Endo-Free Plasmid mini Kit Ⅱ轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒提取試劑盒，北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE9，上海羅氏制藥有限公司產(chǎn)品。

1.1.3引物設(shè)計(jì)及合成參考Hoffmann E等[6]建立的反向遺傳系統(tǒng)設(shè)計(jì)引物，分別在HA基因和NA基因片段添加酶切位點(diǎn)，引物序列為：BmHA-F:5′-CCTTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGG-3′(BsmBⅠ)，BmHA-R:5′-GCATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3′(BsmBΙ)；BaNA-F:5′-CCTTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGAGT-3′(BsaΙ)，BaNA-R: 5′-GCATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3′(BsaΙ)。根據(jù)AIV HA基因序列設(shè)計(jì)糖基化位點(diǎn)突變引物：HA-200-F:5′-ATAAATAGGACCTTCAAACCA-3′，HA-200-R:5′-TGGTTTGAAGGTCCTATTTAT-3′。

1.2　方法

1.2.1病毒HA基因與NA基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以WZP毒株為HA與NA基因供體，通過PCR反應(yīng)克隆目的片段，分別將其插入到pMD18-T載體中進(jìn)行測(cè)序鑒定。以其為模板，分別用定點(diǎn)突變引物BmHA-F/BmHA-R和BaNA-F/BaNA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的片段分別插入到pHW2000載體中，測(cè)序之后得到糖基化位點(diǎn)突變的HA基因和NA基因重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.2重組病毒的拯救將流感病毒8個(gè)基因片段的表達(dá)質(zhì)粒按1∶1的比例混合均勻。按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)36 h，每孔加入5 μL TPCK胰酶，培養(yǎng)12 h后凍融3次。加入雙抗溶液處理1 h，接種SPF雞胚，孵育48 h后收集雞胚尿囊液，檢測(cè)血凝效價(jià)，并通過PCR檢測(cè)鑒定。

1.2.3HA基因三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)用Edit Seq軟件將核酸序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列，然后將這段氨基酸序列上傳到借助SWISS-MODEL預(yù)測(cè)三維蛋白結(jié)構(gòu)網(wǎng)站(http://swissmodel.expasy.org/interactive)，獲得HA基因的三維蛋白結(jié)構(gòu)文件。用Pymol軟件對(duì)獲得的三維蛋白結(jié)構(gòu)文件進(jìn)行可視化操作和修飾，對(duì)比氨基酸突變位點(diǎn)在三維蛋白結(jié)構(gòu)中的變化。

1.2.4病毒洗脫試驗(yàn)由于各病毒株NA基因片段相同，因此比較不同AIV病毒株在雞紅細(xì)胞上的洗脫時(shí)間可以反映出不同HA基因病毒株結(jié)合紅細(xì)胞的能力。將50 μL病毒2倍倍比稀釋為相同的HA效價(jià)，與等體積5 mL/L的雞紅細(xì)胞在96孔血凝板中混合后置于4℃孵育1 h，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。然后將血凝板置于37℃孵育，每隔30 min觀察記錄一次HA效價(jià)，持續(xù)記錄6 h，分別以37℃孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)，HA效價(jià)為縱坐標(biāo)繪制曲線圖。

1.2.5病毒HA熱穩(wěn)定性試驗(yàn)將試驗(yàn)病毒株的尿囊液稀釋為相同的血凝效價(jià)，分別在不同溫度下(37℃～58℃，設(shè)置每1℃為一個(gè)梯度)處理1 h，每個(gè)溫度梯度3個(gè)重復(fù)。對(duì)處理后的病毒通過測(cè)定HA血凝效價(jià)來(lái)判斷HA的熱穩(wěn)定性。

1.2.6病毒雞胚半數(shù)感染量、雞胚平均死亡時(shí)間和生長(zhǎng)曲線的測(cè)定按照試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)步驟測(cè)定雞胚半數(shù)感染量(EID50)和雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)，分別以100EID50的病毒劑量接種9日齡～11日齡SPF雞胚，各接種18枚。每間隔12 h收集1次尿囊液，連續(xù)收集至72 h；每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別收集3枚雞胚尿囊液作為重復(fù)，置-80℃保存。測(cè)定各病毒株不同時(shí)間點(diǎn)收集的尿囊液病毒HA效價(jià)，分別用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍倍比稀釋，接種9日齡～11日齡SPF雞胚測(cè)定EID50。以病毒接種雞胚后的時(shí)間為橫坐標(biāo)，以各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)定的病毒EID50為縱坐標(biāo)，繪制各病毒接種雞胚后的生長(zhǎng)曲線。

2　結(jié)果

2.1　糖基化位點(diǎn)突變重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果

以WZP株為HA基因和NA基因供體，構(gòu)建出HA、NA和HA200 3個(gè)雙向重組表達(dá)質(zhì)粒。其中HA與NA重組質(zhì)粒含有WZP株HA基因與NA基因的完整序列，HA200重組質(zhì)粒改變了HA基因第200位潛在N-糖基化位點(diǎn)，經(jīng)過測(cè)序分析，結(jié)果如圖1所示，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1　HA基因片段與HA200基因片段序列對(duì)比

2.2　病毒拯救及鑒定結(jié)果

通過對(duì)雙表達(dá)重組質(zhì)粒的不同組合，將8種重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，拯救出2株重組病毒r-WZP和r-WZP200，其中r-WZP株缺失HA基因第200位N-糖基化位點(diǎn)，r-WZP200株則含有第200位N-糖基化位點(diǎn)。將2株病毒接種SPF雞胚擴(kuò)繁3代，每代HA效價(jià)(log2)均高于9。通過RT-PCR及測(cè)序?qū)Σ《?個(gè)基因片段進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，其內(nèi)源基因全部來(lái)自病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)，HA基因與NA基因來(lái)自WZP，與預(yù)期結(jié)果相符。

將重組病毒r-WZP株和r-WZP200株進(jìn)行大量增殖并濃縮純化后，通過磷鎢酸負(fù)染后進(jìn)行電鏡觀察。結(jié)果表明，在電鏡下均能觀察到完整的病毒顆粒，并能夠觀察到囊膜纖突，2株病毒的外觀形態(tài)無(wú)明顯區(qū)別，表明所救獲病毒及相關(guān)研究所用材料均為完整的病毒顆粒。

2.3　HA基因三維蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

對(duì)r-WZP株和r-WZP200株的HA基因三維蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，顯示HA蛋白第200位糖基化位點(diǎn)位于HA蛋白頭部，r-WZP200株因?yàn)楸萺-WZP株多出第200位糖基化位點(diǎn)，其蛋白頭部位置可表達(dá)出相應(yīng)的多糖鏈(圖2)。

圖2　r-WZP株和r-WZP200株的HA基因三維蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4　病毒HA的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2株重組病毒的初始HA效價(jià)相同，通過熱處理之后HA效價(jià)均隨著溫度的升高而降低，當(dāng)熱處理溫度達(dá)到56℃時(shí)，r-WZP200株HA效價(jià)為0，當(dāng)熱處理溫度為58℃時(shí)，r-WZP株的HA效價(jià)變?yōu)?。在熱處理溫度為56℃和57℃時(shí)，r-WZP株的HA效價(jià)顯著高于r-WZP200株(圖3)。結(jié)果表明，HA基因第200位糖基化位點(diǎn)的缺失能夠提高病毒HA的熱穩(wěn)定性。

2.5　病毒洗脫試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定2株重組毒株在紅細(xì)胞上的洗脫時(shí)間，從而比較二者HA結(jié)合雞紅細(xì)胞能力的差異。結(jié)果顯示，r-WZP株和r-WZP200株從雞紅細(xì)胞表面解離的時(shí)間分別為5.5 h和6 h。在2.5 h～5.5 h期間，r-WZP株的HA效價(jià)下降速度很快，而r-WZP200株能夠維持更高的HA效價(jià)更長(zhǎng)的時(shí)間，二者差異顯著(圖4)。表明r-WZP200株具有更強(qiáng)的紅細(xì)胞結(jié)合能力。

2.6　病毒MDT及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

測(cè)定病毒在不同稀釋度感染雞胚后收集的尿囊液HA效價(jià)，通過Reed-Muench法計(jì)算， r-WZP株和r-WZP200株的EID50/0.1 mL分別為10-8.333和10-7.5。r-WZP株和r-WZP200株的最小致死量為10-4病毒稀釋度，根據(jù)連續(xù)觀察記錄7 d雞胚死亡時(shí)間，用公式進(jìn)行計(jì)算，r-WZP株的MDT為91.3 h，r-WZP200株的MDT為133 h。

通過測(cè)定r-WZP株和r-WZP200株在不同增殖時(shí)間點(diǎn)每0.1 mL病毒尿囊液的EID50，繪制出二者在雞胚尿囊腔中的增殖曲線。結(jié)果顯示，2株病毒在前期都均呈指數(shù)形式增殖，36 h后增殖到平臺(tái)期，病毒量趨于平穩(wěn)，并且r-WZP株EID50高于r-WZP200，但差異不顯著，表明2株病毒的增殖效率差異不顯著(圖5)。

圖3　不同溫度處理對(duì)r-WZP株和r-WZP200株HA血凝效價(jià)的影響

圖4　病毒從吸附的雞紅細(xì)胞表面洗脫曲線

3　討論

HA蛋白是AIV一種重要的表面糖蛋白，而其本身糖基化位點(diǎn)數(shù)量和位置的變化會(huì)影響蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)和數(shù)量，HA蛋白頭部的糖基化位點(diǎn)尤為重要。針對(duì)人流感病毒(如H1和H3亞型)的研究發(fā)現(xiàn)，糖基化可以幫助病毒逃避宿主的先天性免疫系統(tǒng)，維持病毒的生存[3,7-9]。H5N1亞型AIV HA糖基化位點(diǎn)的缺失能夠影響病毒在不同細(xì)胞中的增殖，并且影響具有多樣性[4,10]。而對(duì)于H9N2亞型AIV糖基化位點(diǎn)的研究鮮有報(bào)道，主要是通過分子流行病學(xué)的調(diào)查，監(jiān)測(cè)糖基化位點(diǎn)的變化。本研究針對(duì)AIV HA基因第200位N-糖基化位點(diǎn)的缺失進(jìn)行了功能性的研究。

圖5　病毒增殖曲線

通過對(duì)AIV HA蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明，第200位N-糖基化位點(diǎn)位于HA蛋白頭部。研究顯示，這一區(qū)域的糖基化位點(diǎn)與病毒適應(yīng)宿主免疫系統(tǒng)的進(jìn)化過程有關(guān)[11]，而在病毒與宿主的協(xié)同進(jìn)化過程中，不僅HA蛋白頭部糖基化位點(diǎn)的缺失在起作用，共同作用的還有其他一些蛋白的基因位點(diǎn)突變，例如PB2、PB1-F2、PA、M和NS1蛋白的部分位點(diǎn)突變均能夠增強(qiáng)病毒毒力和病毒復(fù)制效率[9,11]。此外，頭部糖基化位點(diǎn)的缺失聯(lián)合HA蛋白裂解位點(diǎn)或者受體結(jié)合位點(diǎn)的變化均能夠使病毒更加適應(yīng)宿主的進(jìn)化[12]。

流感病毒感染細(xì)胞過程中，血凝素(HA)與細(xì)胞表面唾液酸受體進(jìn)行特異性結(jié)合，使病毒吸附于細(xì)胞表面，進(jìn)而感染細(xì)胞。而神經(jīng)氨酸酶(NA)具有唾液酸水解活性，能夠切斷病毒與宿主的結(jié)合，起到釋放病毒的作用[13]。本研究中r-WZP株和r-WZP200株的NA基因完全相同，細(xì)胞吸附洗脫試驗(yàn)結(jié)果顯示，r-WZP200株具有更強(qiáng)的結(jié)合紅細(xì)胞能力，即第200位N-糖基化位點(diǎn)的缺失顯著降低了病毒結(jié)合雞紅細(xì)胞的能力。該結(jié)果證明了第200位N-糖基化位點(diǎn)的變化與病毒結(jié)合宿舍受體的能力具有直接關(guān)系。

在病毒感染9日齡～11日齡SPF雞胚的試驗(yàn)中，尿囊腔接種病毒72 h后，收集病毒進(jìn)行EID50的測(cè)定。結(jié)果表明，r-WZP株略高于r-WZP200株，但差異不顯著。但在MDT的測(cè)定中，連續(xù)觀察7 d的結(jié)果顯示，2株病毒對(duì)雞胚的最小致死劑量均為10-4稀釋度，并且在這個(gè)稀釋度時(shí)，r-WZP株的MDT明顯小于r-WZP200株。表明第200位N-糖基化位點(diǎn)的缺失增強(qiáng)了病毒對(duì)雞胚的致死能力。除此之外，同時(shí)對(duì)分離病毒W(wǎng)ZP12株也進(jìn)行了MDT的測(cè)定(本文中未顯示數(shù)據(jù))，發(fā)現(xiàn)WZP12株的MDT為83.4 h，小于r-WZP株。

本研究結(jié)果表明，HA蛋白第200位N-糖基化位點(diǎn)的缺失降低了病毒結(jié)合雞紅細(xì)胞的能力，提高了病毒HA效價(jià)的熱穩(wěn)定性，增強(qiáng)了病毒對(duì)雞胚的致死性。本研究是首次對(duì)H9N2亞型AIV的N-糖基化位點(diǎn)功能進(jìn)行研究，對(duì)H9N2 AIV的致病性研究具有一定的參考價(jià)值。