楊　峰，楊猛超，周宏超，許信剛，張為民*，張　琪*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西供銷福地牧業(yè)有限責(zé)任公司，陜西周至 710400)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒1型，感染豬會(huì)導(dǎo)致豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)，臨床上以嘔吐、泄瀉和脫水為特征。各個(gè)年齡階段的豬均可感染PEDV，而仔豬與其他年齡段豬相比更易感，感染后的發(fā)病率可達(dá)到100%，哺乳仔豬的病死率甚至超過80%[1]。自20世紀(jì)80年代后期該病開始在我國(guó)豬群中大面積流行，保守估計(jì)已有100多萬(wàn)頭的仔豬死亡，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了極為嚴(yán)重的損失[2]。

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)通常采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法檢測(cè)PEDV，但常規(guī)RT-PCR方法在靈敏度和重復(fù)性以及病毒含量確定等方面還存在一些不足[3-4]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好、耗時(shí)短、結(jié)果量化等優(yōu)點(diǎn)，逐漸在實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用[5-10]。RT-qPCR有熒光染料法和TaqMan探針法兩種，由于TaqMan探針法相對(duì)熒光染料法比較昂貴，因此使用最多的是熒光染料法，其中SYBR染料使用的最普遍，但該熒光是一種不飽和熒光，在濃度高的時(shí)候會(huì)對(duì)PCR的擴(kuò)增過程產(chǎn)生一定的抑制，所以在使用時(shí)加入的含量相對(duì)較小，這樣又會(huì)致使DNA的雙鏈位點(diǎn)不能被熒光染料充分的全部結(jié)合。但是Eva Green與此不同，它是飽和熒光染料，沒有非飽和染料“染料重排”的缺點(diǎn)，制作的熔解曲線分辨率相對(duì)較高，而且可以在擴(kuò)增過程當(dāng)中及時(shí)的從DNA雙鏈中釋放出來，從而降低了對(duì)PCR擴(kuò)增過程的影響，因此，使用Eva Green染料定量，比使用SYBR染料準(zhǔn)確性高[11-12]。本研究通過對(duì)NCBI中登錄的PEDV N基因進(jìn)行分析比較，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性的引物，建立基于Eva Green的RT-qPCR 方法，以期為PEDV在臨床檢測(cè)中提供一種快速、特異、靈敏、定量的方法。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1毒株、菌株及病料豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒( Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存并提供；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自康維世紀(jì)生物科技公司；病料為陜西省不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)臨床剖檢疑似PEDV感染的病死仔豬小腸內(nèi)容物，加適量PBS并凍融3次后置-80℃保存，共43份。

1.1.2主要試劑 DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000和2×TaqMaster Mix，康維世紀(jì)生物科技公司產(chǎn)品；Trizol試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，天根生化科技公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒、pEAST-T1克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，全式金生物公司產(chǎn)品；2×Eva Green Premix，ABM 生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.3引物設(shè)計(jì)及合成 參考NCBI中登錄的PEDV N基因序列(KM609210. 1、KT021227.1、KM242131.1、JX261936.1、AF353511.1等)，使用DNA Star軟件進(jìn)行比對(duì)分析保守序列，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物。所設(shè)計(jì)的熒光定量特異性上、下游引物序列分別為PEDV-F：5′ -TGAGGGTGTT-TTCTGGGTTG-3′ ，PEDV-R：5′ -TTGCCATTGCCACGACTC-3′ ，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為192 bp。引物由西安擎科澤西生物公司合成，稀釋至10 μmol/L，置4℃保存?zhèn)溆?。常?guī)RT-PCR引物由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 326 bp[13]。

1.2　方法

1.2.1PEDV RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 取PEDV細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL，使用Trizol法提取RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA，置-20℃存儲(chǔ)或進(jìn)行常規(guī)RT-PCR試驗(yàn)。

1.2.2常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系20 μL：2×TaqMaster Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，模板cDNA 3 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s， 72℃ 1 min，循環(huán)30次；72℃再延伸10 min。

1.2.3RT-qPCR陽(yáng)性質(zhì)粒及標(biāo)準(zhǔn)模板制備 按照膠回收試劑盒回收1.2.2擴(kuò)增的目的片段，并將其按照pEAST-T1克隆試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒菌。重組質(zhì)粒菌經(jīng)常規(guī)PCR鑒定為陽(yáng)性后，將重組質(zhì)粒菌中的陽(yáng)性質(zhì)粒按照試劑盒的操作步驟提取，進(jìn)行測(cè)序分析。用超微量光譜分析儀測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒濃度，按照以下公式將濃度轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)，然后進(jìn)行梯度稀釋。稀釋后的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板，置-20℃保存?zhèn)溆??？截悢?shù)(copies/μL) =C×NA/MW，其中C為陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)定的濃度，單位ng/μL，NA取值為6.02×1023copies/mol，MW為平均分子量，單位為Dolton。

1.2.4RT-qPCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系10 μL：2×Eva Green Premix 5 μL，ddH2O 3.4 μL，標(biāo)準(zhǔn)模板1 μL，上游引物和下游引物各 0.3 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 3 s，60℃ 30 s，循環(huán)35次。

1.2.5RT-qPCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 選取濃度分別為1×108拷貝/μL～1×103拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽(yáng)性模板，以雙蒸水為陰性對(duì)照模板，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。結(jié)果以RT-qPCR儀自帶軟件分析繪制擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。

1.2.6RT-qPCR特異性試驗(yàn) 用建立的RT-qPCR方法分別檢測(cè)PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV提取后逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，驗(yàn)證建立的RT-qPCR方法的特異性。

1.2.7RT-qPCR靈敏性試驗(yàn) 選取濃度為1×104拷貝/μL～1×100拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽(yáng)性模板，以雙蒸水為陰性對(duì)照模板，分別進(jìn)行RT-qPCR方法和常規(guī)PCR方法擴(kuò)增，將所得結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，比較所建立的RT-qPCR方法和常規(guī)PCR方法的靈敏程度。

1.2.8RT-qPCR重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一批次不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板和不同批次不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽(yáng)性模板，以雙蒸水為陰性對(duì)照模板，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，分別計(jì)算組內(nèi)和組間變異系數(shù)。

1.2.9臨床樣本的檢測(cè) 將不同豬場(chǎng)送檢的疑似PEDV感染的小腸內(nèi)容物樣品做待測(cè)樣品，以標(biāo)準(zhǔn)模板做陽(yáng)性對(duì)照模板，以ddH2O為陰性對(duì)照模板，用所建立的RT-qPCR方法檢測(cè)，然后將RT-qPCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行常規(guī)PCR方法檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行比較。

2　結(jié)果

2.1　常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增

對(duì)PEDV進(jìn)行常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果與預(yù)期大小一致，目的片段為1 326 bp，而且無(wú)雜帶(圖 1)，說明提取并逆轉(zhuǎn)錄得到的為PEDV的cDNA，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2　陽(yáng)性質(zhì)粒常規(guī)PCR鑒定

將菌液用PEDV熒光定量特異性引物進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增到192 bp目的片段(圖2)，結(jié)果說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，且設(shè)計(jì)的引物可作為PEDV的特異性引物。將鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST，結(jié)果同源性達(dá)99%。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.PEDV常規(guī)RT-PCR產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1.RT-PCR products of PEDV;2.Negative control

圖1常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1Amplification result of PEDV by RT-PCR

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.陽(yáng)性質(zhì)粒常規(guī)PCR產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 000;1.PCR products of positive plasmids;2.Negative control

圖2陽(yáng)性質(zhì)粒常規(guī)PCR鑒定

Fig.2The conventional PCR identification of positive plasmids

2.3　RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)模板的制備

用超微量光譜分析儀測(cè)定提取質(zhì)粒的濃度45.09 ng/μL，A260/A280值為1.796，計(jì)算得拷貝數(shù)為7.83×109拷貝/μL，將其稀釋至濃度分別為1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷貝/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4　RT-qPCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)模板的擴(kuò)增曲線如圖3所示,相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示,其熔解曲線如圖5所示。在1×103拷貝/μL ～1×108拷貝/μL濃度范圍內(nèi)，所得拷貝數(shù)(x)與Ct值(y)的線性方程為y=-3.359x+40.388，斜率為-3.359，截距為40.388，線性相關(guān)系數(shù) R2=0.999，顯示了良好的線性關(guān)系。熔解曲線峰型單一，無(wú)雜峰，熔解溫度一致， Tm=82.22℃。

2.5　RT-qPCR特異性試驗(yàn)

分別以PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV提取后逆轉(zhuǎn)錄得到的的cDNA為反應(yīng)模板，用建立的RT-qPCR方法擴(kuò)增，結(jié)果表明只有PEDV有熒光信號(hào)(圖6)，說明所建立的RT-qPCR方法特異性好。

2.6　RT-qPCR敏感性試驗(yàn)

以1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板為反應(yīng)模板，進(jìn)行RT-qPCR方法擴(kuò)增，結(jié)果顯示RT-qPCR方法檢測(cè)的最低拷貝數(shù)為1×101拷貝/μL(圖7)。以 1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板為反應(yīng)模板，以常規(guī)PCR方法擴(kuò)增，結(jié)果顯示,常規(guī)PCR 方法檢測(cè)的最低拷貝數(shù)為1×103拷貝/μL(圖8)。結(jié)果表明，所建立 RT-qPCR方法比常規(guī)RT-PCR方法靈敏100倍。

1～6.1×108拷貝/μL～1×103拷貝/μL 6個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)模板的RT-qPCR擴(kuò)增曲線； NC.陰性對(duì)照

1-6.RT-qPCR curves of 1×108copies/μL to 1×103copies/μL diluted standard template,respectively;NC.Negative control

圖3實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

Fig.3RT-qPCR amplification curve

圖4　實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5　實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線

圖6　RT-qPCR特異性試驗(yàn)

1～5.1×104拷貝/μL～1×100拷貝/μL 5個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)模板的RT-qPCR擴(kuò)增曲線；NC.陰性對(duì)照

1-5.RT-qPCR amplification curves of 1×104copies/μL to 1×100copies/μL diluted standard template,respectively;NC.Negative control

圖7RT-qPCR靈敏性試驗(yàn)

Fig.7RT-qPCR sensitivity test

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～5.1×104拷貝/μL～1×100拷貝/μL 5個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)模板的常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；NC.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1-5.The conventional PCR products of 1×104copies/μL to 1×100copies/μL diluted standard template;NC.Negative control

圖8常規(guī)PCR靈敏性試驗(yàn)

Fig.8 The conventional PCR sensitivity test

2.7　RT-qPCR重復(fù)性試驗(yàn)

以1×108、1×107、1×106拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板為反應(yīng)模板，每個(gè)模板做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(表1)，每隔1周做1次，每次做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均值，做3次，進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果表明,變異系數(shù)均在5%以下(表2)，說明所建立的RT-qPCR方法在重復(fù)性較好。

2.8　檢測(cè)方法的應(yīng)用

對(duì)疑似的43份臨床樣品，用常規(guī)RT-PCR方法和建立的RT-qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果建立的RT-qPCR方法檢測(cè)為42份陽(yáng)性，1份陰性，用常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)為40份陽(yáng)性，3份陰性。說明本研究建立的RT-qPCR方法比常規(guī) RT-PCR靈敏性高，可以在PEDV的臨床檢測(cè)中應(yīng)用。

表1　RT-qPCR組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)

表2　RT-qPCR組間重復(fù)試驗(yàn)

3　討論

由于PED對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的損失很大，而且與其他傳染病，尤其是TGE的臨床癥狀和病理變化非常相似，在臨床鑒別時(shí)比較困難，只能結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診。在目前的檢測(cè)方法(如常規(guī)RT-PCR、LAMP、ELISA和免疫熒光等技術(shù))中，用熒光標(biāo)記方法檢測(cè)特異性產(chǎn)物的RT-qPCR技術(shù)，因其靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、耗時(shí)短、過程封閉等眾多優(yōu)點(diǎn)，逐漸在病原體檢測(cè)、目的基因表達(dá)量、疫苗質(zhì)量控制等方面得到廣泛的使用[14]。因?yàn)闊晒馊玖蠋缀蹩梢院腿魏蜠NA雙鏈結(jié)合，所以要求RT-qPCR熒光染料法的引物在設(shè)計(jì)時(shí)要認(rèn)真考慮長(zhǎng)度、退火溫度、保守性、二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等問題，尤其是其中的引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)問題，其關(guān)系到定量的準(zhǔn)確性[15]。在試驗(yàn)過程中，還要注意做好防污染工作，盡管試驗(yàn)操作比較簡(jiǎn)單，但操作中的污染，如氣溶膠的污染會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果；在制作標(biāo)準(zhǔn)模板時(shí)，要使陽(yáng)性質(zhì)粒完全混合均勻，以此保證標(biāo)準(zhǔn)模板的濃度梯度正確性。這些問題考慮的越周全，得到的結(jié)果越穩(wěn)定和可靠。

本研究根據(jù)NCBI上登錄的PEDV N基因，設(shè)計(jì)了1對(duì)用于RT-qPCR擴(kuò)增目的片段為192 bp的特異性引物，構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板，使用Eva Green作為熒光標(biāo)記染料，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，建立的PEDV RT-qPCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，各梯度標(biāo)準(zhǔn)模板擴(kuò)增效率一致，熔解曲線峰型單一。本研究建立的PEDV RT-qPCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，只能檢測(cè)出PEDV，最低檢測(cè)拷貝數(shù)為1×101拷貝/μL，比常規(guī) RT-PCR相比靈敏100倍。組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5%，重復(fù)性良好。用建立的RT-qPCR方法檢測(cè)43份疑似PEDV感染樣品，結(jié)果42份為陽(yáng)性，而常規(guī)RT-PCR只能檢測(cè)出40份陽(yáng)性病料，漏檢2份陽(yáng)性病料。整個(gè)RT-qPCR擴(kuò)增過程只需45 min，耗時(shí)短。在臨床上應(yīng)用本方法，可以特異、快速、定量的檢測(cè)出PEDV，從而使養(yǎng)殖者迅速制定PEDV的防控措施，以減少經(jīng)濟(jì)損失。綜上所述，本研究建立的豬流行性腹瀉病毒實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性，而且耗時(shí)短，可用于臨床檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒感染。