路 帥,孫培冬,季曉彤,孫菡崢

(1.江南大學(xué)食品膠體與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室,江蘇無錫 214122; 2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

杏仁是薔薇科杏(AmygdalusCommunisVas)的種子,營養(yǎng)價值豐富,每100 g杏仁中含有蛋白質(zhì)25～27 g、油脂47～56 g、碳水化合物及粗纖維12～19 g,另外還富含多種礦質(zhì)元素和維生素[1-2],經(jīng)脫苦去毒等初步加工后,即可用于食品。另外,杏仁亦具有藥用價值,如祛風(fēng)寒、止咳、治療哮喘、消腫通氣、降血脂等[2],但這些作用目前遠(yuǎn)未得到充分應(yīng)用。近年來,蛋白質(zhì)水解所得的多肽由于具有特殊的營養(yǎng)及多種生物活性[3-5],已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。有研究發(fā)現(xiàn),杏仁蛋白酶解得到的多肽具有抗疲勞、調(diào)節(jié)激素分泌、調(diào)節(jié)生理代謝、促進(jìn)礦質(zhì)吸收、增進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、降血壓、抗氧化等特性[3-5]。因此,有效地提取、純化杏仁蛋白,有利于進(jìn)一步制備生物活性多肽,提高杏仁產(chǎn)品的附加值,擴(kuò)大杏仁的工業(yè)應(yīng)用范圍。

目前提取杏仁蛋白傳統(tǒng)方法主要是堿溶酸沉法[6],但較長時間的熱堿液浸提不僅會造成蛋白質(zhì)的變性和有害物質(zhì)的生成,另外在調(diào)節(jié)pH的過程中還會引入較多的無機(jī)鹽,對蛋白后續(xù)加工利用造成不良影響[7]。因為杏仁蛋白由于具有良好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性[7],可以采用泡沫分離法進(jìn)行提取純化。泡沫分離法[8]是根據(jù)表面吸附原理,通過向溶液中鼓泡,使具有表面活性的溶質(zhì)或顆粒吸附到氣-液界面上,以氣泡為載體與液相主體進(jìn)行分離的方法,由于蛋白質(zhì)分子具有表面活性,所以可采用泡沫分離法實現(xiàn)分離純化[9]。與其它蛋白分離方法相比,泡沫分離法污染小、操作條件溫和、不破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物活性。目前,泡沫分離法已應(yīng)用于提取免疫球蛋白[10]、大豆蛋白[11]、桑葉蛋白[12]、亞麻蛋白[13]等。

本文采用兩級泡沫分離法提取杏仁蛋白,對提取條件進(jìn)行優(yōu)化,并應(yīng)用田口實驗設(shè)計法確定提高杏仁蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和回收率的最優(yōu)條件,旨在為杏仁蛋白的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏仁 河北承德市農(nóng)貿(mào)市場;石油醚、鹽酸、對硝基苯酚、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、乙酸鈉、乙酸、甲醛、乙酰丙酮 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TU-1900型紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;LZB型玻璃轉(zhuǎn)子流量計 南京順來達(dá)測控設(shè)備有限公司;PHS-25型pH計 上海精密儀器制造有限公司;ME203E型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;LDZ4-2型自動平衡離心機(jī) 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;LyoQuest-85型冷凍干燥機(jī) 西班牙Telstar公司;泡沫分離裝置 自制,包括氮?dú)馄?、玻璃轉(zhuǎn)子流量計、氣體分布器、泡沫分離柱、泡沫收集器,泡沫分離柱為有機(jī)玻璃制成,內(nèi)徑35 mm,柱高600 mm,分離柱底部安裝氣體分布器。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏仁原料脫脂預(yù)處理 參考文獻(xiàn)[14],取一定量的杏仁干燥、粉碎后過80目篩,以石油醚(料液比1∶10)浸提6 h脫脂,重復(fù)浸提3次后干燥得到脫脂后的杏仁粕,置于-4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2 杏仁原料成分的測定 水分含量的測定:直接干燥法(GB 5009.3-2016)[15];脂肪含量的測定:索氏抽提法(GB 5009.6-2016)[16];蛋白質(zhì)含量的測定:凱氏定氮法(GB 5009.5-2016)[17];灰分含量的測定:灼燒法(GB 5009.4-2016)[18];多糖含量的測定:苯酚-硫酸法(SN/T 4260-2015)[19]。

1.2.3 杏仁蛋白的泡沫分離工藝 將按照1.2.1中方法制得的杏仁粕用去離子水配制成不同進(jìn)料濃度的料液500 mL,以稀鹽酸調(diào)節(jié)進(jìn)料的pH,料液倒入泡沫分離柱中后通入氮?dú)?以轉(zhuǎn)子流量計測量氣速。泡沫收集器中的泡沫采用攪拌法消泡,消泡后調(diào)節(jié)pH7,置于冰箱-25 ℃冷凍2 h,然后將冷凍樣品放入冷凍干燥機(jī)中,-50 ℃冷凍干燥48 h后取出并研磨成杏仁蛋白粉。

1.2.4 杏仁蛋白等電點(diǎn)測定 參照文獻(xiàn)[20],用去離子水將杏仁蛋白配制成料液比1∶5的懸濁液,攪拌2 h后離心20 min取上清液。用NaOH溶液或 HCl溶液將上清液的pH從1間隔1依次調(diào)至12,在320 nm波長處用分光光度計測量吸光度,吸光度最大時的pH即為杏仁蛋白等電點(diǎn)。

1.2.5 杏仁蛋白質(zhì)回收率的計算

式中:Pf-杏仁蛋白粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù),%;Pi-杏仁粕的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù),%;Mf-杏仁蛋白粉質(zhì)量,g;Mi-杏仁粕的質(zhì)量,g。

1.2.6 單因素實驗 采用1.2.3的工藝提取杏仁蛋白,固定提取條件為進(jìn)料濃度6 g·L-1、鼓泡氣速400 mL·min-1、鼓泡時間20 min,考察不同進(jìn)料pH(3、4、5、6、7)對蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和回收率的影響;固定條件為進(jìn)料pH4、鼓泡氣速400 mL·min-1、鼓泡時間20 min,考察不同進(jìn)料濃度(2、4、6、8、10 g·L-1)對蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和回收率的影響;固定提取條件為進(jìn)料pH4、進(jìn)料濃度為6 g·L-1、鼓泡時間為20 min,考察不同鼓泡氣速(200、300、400、500、600 mL·min-1)對蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和回收率的影響;固定提取條件為進(jìn)料pH4、進(jìn)料濃度為6 g·L-1、鼓泡氣速為400 mL·min-1,考察不同鼓泡時間(10、15、20、25、30 min)對蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和回收率的影響。

1.2.7 田口方法優(yōu)化泡沫分離工藝 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用田口方法進(jìn)一步優(yōu)化泡沫分離工藝,設(shè)計條件不同的9個實驗,每個實驗重復(fù)3次。

田口方法將各品質(zhì)特性轉(zhuǎn)化為信噪比(S/N),質(zhì)量特性越好的設(shè)計方案其信噪比也越大,利用信噪比找出品質(zhì)特性最佳且變異最小的設(shè)計方案[21]。信噪比代表的質(zhì)量特性分為望小特性、望大特性和望目特性。當(dāng)研究目的是減少圍繞目標(biāo)值的變異時,采用望目特性;如果質(zhì)量特性為越大越好,采用望大特性;如果質(zhì)量特性為越小越好,采用望小特性[22]。泡沫分離杏仁蛋白的回收率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)都是越大越好,故采用望大特性進(jìn)行研究,其信噪比計算公式為:

式中:S/N為信噪比,yi為第i次實驗結(jié)果,n為實驗重復(fù)次數(shù)。

田口方法首先采用正交表安排實驗,以信噪比(S/N)作為衡量產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性的指標(biāo),找出抗干擾能力強(qiáng)、性能穩(wěn)定的最佳參數(shù)水平組合。本文所選因素及水平采用L9(34)正交表安排實驗,見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Independent variables and their levels used in the orthogonal test

1.2.8 兩級泡沫分離工藝 采用田口方法優(yōu)化后的實驗方案對杏仁粕進(jìn)行兩級泡沫分離,由于實驗?zāi)康氖亲畲笙薅鹊丶兓尤实鞍?故選擇使蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的實驗方案。將杏仁粕按照優(yōu)化后的實驗方案進(jìn)行泡沫分離后冷凍干燥得到一級泡沫分離杏仁粉。一級泡沫分離杏仁粉按照相同的實驗條件再進(jìn)行泡沫分離后冷凍干燥得到二級泡沫分離杏仁粉。分別測量杏仁粕、一級泡沫分離杏仁粉和二級泡沫分離杏仁粉的質(zhì)量及蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab 17.0軟件進(jìn)行田口實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理,Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂后杏仁粕的主要成分

由表2可見,杏仁脫脂后脂肪含量僅為6.96%,脫脂效果較為明顯。由于油脂與蛋白質(zhì)結(jié)合會使杏仁極易氧化酸敗,且脂質(zhì)次級氧化產(chǎn)物會損壞氨基酸序列,因此,脫脂可防止蛋白發(fā)生腐壞變性[23]。

表2 杏仁粕主要成分Table 2 The main composition of almond cake

2.2 杏仁蛋白等電點(diǎn)的測定

蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定,有利于研究pH對泡沫分離杏仁蛋白的影響。由圖1可知,杏仁蛋白提取液經(jīng)離心分離后,pH的變化使得上清液的吸光度之變化,隨著pH的增加,吸光度先增加后降低,在pH為4時達(dá)到峰值,故杏仁蛋白等電點(diǎn)為4。

圖1 杏仁蛋白等電點(diǎn)的測定Fig.1 Determination of isoelectric point of almond protein

2.3 杏仁蛋白泡沫分離的單因素實驗

2.3.1 進(jìn)料 pH對杏仁蛋白泡沫分離效果的影響 形成穩(wěn)定的泡沫是進(jìn)行泡沫分離的先決條件。而泡沫穩(wěn)定性主要取決于泡沫液膜的表面粘度、彈性和表面張力。降低表面張力可以提高泡沫的穩(wěn)定性,穩(wěn)定的泡沫可以使分離過程持續(xù)至殘留液相濃度很低的狀態(tài)[24]。由圖2可知,在杏仁蛋白等電點(diǎn)處即pH4處進(jìn)行的泡沫分離得到的產(chǎn)物回收率和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均最大,而當(dāng)pH偏離等電點(diǎn)時,蛋白質(zhì)的回收率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)均下降,這是由于在蛋白等電點(diǎn)處體系處于表面張力較低的狀態(tài)。為了純化杏仁蛋白,故選擇進(jìn)料pH為4為宜。

圖2 進(jìn)料pH對蛋白泡沫分離的影響Fig.2 Effect of pH on foam separation

2.3.2 進(jìn)料濃度對杏仁蛋白泡沫分離效果的影響 由圖3可以看出,隨著進(jìn)料濃度增大時,蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降,蛋白回收率增大。原因可能是,當(dāng)進(jìn)料濃度較大時,泡沫層泡沫豐富且泡沫在上升過程中穩(wěn)定性較好,不易發(fā)生泡沫隔膜破裂和泡沫合并,間隙排液量少,故泡沫分離裝置流出的泡沫持液量大,泡沫層間隙液體夾帶的多糖、脂肪等雜質(zhì)含量較多,導(dǎo)致蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降,但殘液中蛋白殘留相對較少,蛋白回收率增大。當(dāng)進(jìn)料濃度較小時,泡沫層在上升過程中不斷發(fā)生泡沫隔膜破裂及泡沫合并,間隙排液量大,泡沫層間隙液體夾帶的多糖、脂肪等雜質(zhì)含量減少,蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升,但蛋白在殘液中有較多殘留,蛋白回收率減少。為了純化杏仁蛋白,故選擇進(jìn)料濃度6 g/L為宜。

圖3 進(jìn)料濃度對泡沫分離的影響Fig.3 Effect of feed concentration on foam separation

2.3.3 鼓泡氣速對杏仁蛋白泡沫分離效果的影響 鼓泡氣速主要影響泡沫層中的排液行為,氣泡沿著泡沫分離裝置的軸向由下向上流動,泡沫層間隙夾帶的液體由上向下發(fā)生排液現(xiàn)象[25]。由圖4可以看出,隨著鼓泡氣速增大,蛋白回收率先迅速增大,在400 mL/min后,趨于平緩,而蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)一直較緩下降。原因可能是,當(dāng)鼓泡氣速較大時,氣泡的流動速率大,泡沫上升過程鼓泡時間較短,導(dǎo)致泡沫層間隙排液量減少,故泡沫分離裝置流出的泡沫持液量大,液體夾帶的雜質(zhì)含量增多,蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降,但蛋白回收率增大。當(dāng)鼓泡氣速較低時,泡沫上升過程鼓泡時間較長,泡沫間隙排液量增多,隨著鼓泡時間推移,泡沫分離柱內(nèi)料液蛋白含量逐漸減少,料液起泡性及泡沫穩(wěn)定性減弱,鼓泡氣速過小不易將泡沫層從泡沫分離柱上方鼓出,蛋白回收率減小。為了純化杏仁蛋白,故選擇鼓泡氣速400 mL/min為宜。

圖4 鼓泡氣速對蛋白泡沫分離的影響Fig.4 Effect of gas velocity on foam separation

2.3.4 鼓泡時間對杏仁蛋白泡沫分離效果的影響 由圖5可以看出,當(dāng)鼓泡時間較短時,杏仁蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大,但由于鼓泡不充分,蛋白在泡沫分離裝置殘液中也有較多殘留,蛋白回收率較小。隨著鼓泡時間延長,泡沫層的間隙夾帶的雜質(zhì)也越來越多地從泡沫分離裝置中鼓出,造成蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降,但蛋白在泡沫分離裝置內(nèi)殘液中殘留較少,蛋白回收率相應(yīng)增大。為了純化杏仁蛋白,回收率僅作為輔助指標(biāo),故選擇鼓泡時間10 min為宜。

圖5 鼓泡時間對蛋白泡沫分離的影響Fig.5 Effect of bubble time on foam separation

2.4 田口方法優(yōu)化泡沫分離工藝

由表3可知,在進(jìn)料pH4,進(jìn)料濃度6 g/L,鼓泡氣速 400 mL/min,鼓泡時間10 min條件下,杏仁蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到75.23±0.17%。在進(jìn)料pH4,進(jìn)料濃度10 g/L,鼓泡氣速 600 mL/min,鼓泡時間30 min條件下,杏仁蛋白回收率最高達(dá)到81.08%±0.13%。

表3 田口方法優(yōu)化泡沫分離工藝結(jié)果Table 3 Optimization of foam separation process by Taguchi method

2.5 信噪比分析

將各因素在各自不同水平下的信噪比值計算均值,從而分析出各因素對杏仁蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和回收率的影響大小,并繪制出各因素信噪比均值隨不同水平的變化趨勢圖,見圖6和圖7。

圖6 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)信噪比趨勢圖Fig.6 Noise-signal ratio trend of protein mass fraction

由圖6可知,進(jìn)料pH(A)的1號水平,進(jìn)料濃度(B)的1號水平,鼓泡氣速(C)的1號水平和鼓泡時間(D)的1號水平可分別提高杏仁蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的信噪比,根據(jù)田口方法的望大特性,信噪比越大的方案抗外界干擾能力越強(qiáng),其質(zhì)量特性也最好,故A1B1C1D1是提高杏仁蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳方案。

由圖7可知,進(jìn)料pH(A)的1號水平,進(jìn)料濃度(B)的2號水平,鼓泡氣速(C)的3號水平和鼓泡時間(D)的3號水平可分別提高杏仁蛋白回收率的信噪比,根據(jù)田口方法的望大特性,信噪比越大的方案抗外界干擾能力越強(qiáng),其質(zhì)量特性也最好,故A1B2C3D3是提高杏仁蛋白回收率的最佳方案。

圖7 蛋白回收率信噪比趨勢圖Fig.7 Noise-signal ratio trend of protein recovery rate

2.6 兩級泡沫純化杏仁蛋白結(jié)果

為了之后進(jìn)一步研究杏仁蛋白、多肽的生物活性,所以要最大限度地提純杏仁蛋白,回收率作為輔助指標(biāo)是為工業(yè)應(yīng)用中的成本控制作考慮的,所以選擇最有利于提高蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的A1B1C1D1條件組合對杏仁粕進(jìn)行兩級泡沫分離。

如表4所示,經(jīng)過第一級泡沫分離后,杏仁蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由杏仁粕中的51.17%增加到75.23%,蛋白質(zhì)回收率為79.48%;取一級泡沫分離得到的杏仁蛋白粉按照相同的實驗條件進(jìn)行二級泡沫分離,最終所得的杏仁蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.71%,蛋白質(zhì)回收率為71.19%,實現(xiàn)了杏仁蛋白的精制純化。

表4 兩級泡沫分離杏仁蛋白結(jié)果Table 4 Results of two stage foam separation of almond protein

3 結(jié)論

考察了泡沫分離法中進(jìn)料pH、進(jìn)料濃度、鼓泡氣速和鼓泡時間對杏仁蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及回收率的影響并應(yīng)用田口實驗設(shè)計法優(yōu)化了實驗方案,選取蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和回收率的信噪比(S/N)值作為評價指標(biāo)來衡量實驗效果。通過統(tǒng)計分析確定了提高杏仁蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與回收率最優(yōu)的實驗條件。確定了最優(yōu)的兩級泡沫分離法純化杏仁蛋白的工藝。在裝液體積為500 mL,進(jìn)料pH為4,進(jìn)料濃度6 g/L,鼓泡氣速為400 mL/min,鼓泡時間為10 min的條件下,一級泡沫分離杏仁蛋白粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.23%,蛋白回收率為79.48%。將一級泡沫分離產(chǎn)物冷凍干燥后作為二級泡沫分離的原料,在相同的操作條件下,二級泡沫分離杏仁蛋白粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.71%,蛋白回收率為71.19%。實驗表明兩級泡沫分離法可有效提取純化杏仁蛋白,可作為一種高效、節(jié)能、環(huán)保且低成本的植物蛋白分離精制技術(shù),為之后研究杏仁多肽的生物活性打下基礎(chǔ)。