高俊乾,黃俊元,張君奇,蔡佳佳,亓正良,劉 浩

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457)

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,EC 3.1.3.1,簡稱AKP)是一類普遍存在于生物體內(nèi)的非特異磷酸單酯酶[1],可以催化幾乎所有磷酸單酯的水解反應(yīng),因其在堿性環(huán)境下最為有效,故得名堿性磷酸酶。堿性磷酸酶是一組同工酶,多為同源二聚體蛋白。堿性磷酸酶在生物體內(nèi)可直接參與鈣、磷的消化吸收分泌及骨化過程等[2],還可以用于免疫學(xué)酶聯(lián)免疫吸附測定[3]和免疫印跡分析[4-5]、生物傳感器識別元件的構(gòu)建[6](如有機磷農(nóng)藥降解[7]、水體富營養(yǎng)化檢測[8-9]、環(huán)境監(jiān)測[10]、含磷有機物質(zhì)的礦化過程[11]等)、非同位素探針[12]和斑點雜交[13]等方面。因此堿性磷酸酶具有較高的應(yīng)用價值。

Remy Albrecht等[10]在綠色廢物和污水污泥共堆肥中測定的堿性磷酸酶活力最高為1117 U;Adrianne NEdwards等[14]在Clostridium difficile中過表達phoZ基因,堿性磷酸酶酶活最高為4830 U;莊百川[15]在芽孢桿菌中測定得到堿性磷酸酶活性最高為2250 U。目前商品化的堿性磷酸酶主要來源于動物體或植物體,但其產(chǎn)率低、價格昂貴、活性差,使它的使用受到限制[15],因此篩選具有產(chǎn)量高、活性高的堿性磷酸酶微生物菌種顯得尤為重要。

本文從土壤中篩選到一株高產(chǎn)堿性磷酸酶菌株,對影響其產(chǎn)堿性磷酸酶的主要因素碳源、氮源、無機鹽及初始pH進行研究,在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化產(chǎn)酶,從而為堿性磷酸酶生產(chǎn)提供了新的微生物資源,同時對該菌產(chǎn)堿性磷酸酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 天津大港海水養(yǎng)殖場附近;KOD plus聚合酶、PCR配套緩沖液 東洋紡(上海)生物科技有限公司;DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品 北京全式金生物技術(shù)有限公司;片段回收試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;瓊脂糖 Sunbiotech公司;硝酸鹽還原試劑盒 青島海博生物技術(shù)有限公司;革蘭氏染色試劑盒 北京索來寶科技有限公司;其它試劑 均為分析純。

產(chǎn)堿性磷酸酶篩選培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,硫酸銨0.5,氯化鈉0.3,氯化鉀0.3,MgSO4·7H2O 0.3,FeSO4·7H2O 0.03,MnSO4·H2O 0.03,CaCl2·2H2O 5,卵磷脂0.2,pH7.2,瓊脂粉20;堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,硫酸銨0.5,氯化鈉0.3,氯化鉀0.3,MgSO4·7H2O 0.3,FeSO4·7H2O 0.03,MnSO4·H2O 0.03,CaCl2·2H2O 5,卵磷脂0.5,pH7.2;Modified Universal Buffer(MUB)(g/L)[16]:硼酸6.3,檸檬酸14.0,順丁烯二酸11.6,三羥甲基氨基甲烷12.1,氫氧化鈉19.52,pH11.0。

pH計 梅特勒-托利多儀器上海公司;雙目生物顯微鏡 日本OLYPUS公司;5415R型小型冷凍離心機 德國Eppendorf公司;DH-4000B電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;HNY-200B控溫搖床 上海志誠設(shè)備廠;PTC-200型PCR儀 德國Eppendorf公司;ChampGel 5500 凝膠成像儀 北京賽智生物技術(shù)有限公司;UV-1800型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株初篩 將采集的土壤樣品采用梯度稀釋(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8),分別取100 μL稀釋樣品涂布于產(chǎn)堿性磷酸酶篩選培養(yǎng)基[15],30 ℃培養(yǎng)7 d。每個梯度3平行,待平板長出單菌落后,測量透明圈直徑D(mm)和菌落直徑d(mm),計算D/d,挑選D/d值較大的菌株進行復(fù)篩。

1.2.2 菌株復(fù)篩 將初篩得到菌株接入堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基,在30 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)60 h,測定堿性磷酸酶活力,得酶活力最高的菌株,并編號進行后續(xù)研究。

1.2.3 磷酸酶活力測定 吸取1 mL發(fā)酵液,加入4 mL pH11.0的MUB緩沖液中,再加入0.025 mol/L對硝基苯磷酸二鈉(PNPP)溶液1 mL后振蕩,37 ℃反應(yīng)1 h,加入0.5 mol/L氯化鈣溶液1 mL和0.5 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL,振蕩后4000 r/min離心10 min,取上清液在420 nm比色[17]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取6支比色管,依次吸取1 g/L標(biāo)準(zhǔn)對硝基酚溶液0、1、2、3、4、5 mL分別裝于比色管中,用無菌水定容至5 mL。在每個比色管中再加入0.5 mol/L氯化鈣溶液1 mL、0.5 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL,振蕩后過濾或4000 r/min離心10 min,420 nm條件下測定吸光度。堿性磷酸酶活性以每分鐘OD420增加0.001為一個酶活力單位(U)。

1.2.4 菌株菌落形態(tài)對比觀察 將篩選得到的高產(chǎn)堿性磷酸酶菌株與其它產(chǎn)酶優(yōu)勢菌株點接在產(chǎn)酶固體培養(yǎng)基上,對高產(chǎn)堿性磷酸酶菌株形態(tài)進行對比觀察。

1.2.5 生理生化鑒定 方法參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]和《伯杰細菌鑒定手冊》[19]。

1.2.6 分子生物學(xué)鑒定

1.2.6.1 引物的設(shè)計與合成 提取此菌株的總DNA,利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增,引物序列為Prime 935:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,Prime 936:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.2.6.2 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系為:10×PCR Buffer 2 μL,dNTPs(2 mmol/L)0.2 mmol/L,MgSO4(25 mmol/L)0.8 μL上游引物和下游引物各0.2 μmol/L,模板1 μg,KOD plus DNA聚合酶2 U,加無菌水至終體積為20 μL。

PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性15 s,56 ℃退火30 s,68 ℃延伸1.5 min,反應(yīng)35個循環(huán),68 ℃后延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.2.6.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 純化上述基因克隆產(chǎn)物后,送北京華大基因公司測序。將測序結(jié)果在GenBanK核酸序列數(shù)據(jù)庫進行序列比較,采用MEGA6軟件進行同源性分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7 不同單因素對高產(chǎn)堿性磷酸酶菌株產(chǎn)酶活力的影響

1.2.7.1 不同碳源對高產(chǎn)堿性磷酸酶菌株產(chǎn)酶活力的影響 以產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基為對照,分別用10 g/L果糖、蔗糖、乳糖、木糖和麥芽糖代替堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖,30 ℃、200 r/min搖瓶發(fā)酵60 h,取其發(fā)酵液,分別測定其堿性磷酸酶活力。

1.2.7.2 不同氮源對高產(chǎn)堿性磷酸酶菌株產(chǎn)酶活力的影響 以產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基為對照,在無硫酸銨的堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.5 g/L氯化銨、蛋白胨、酵母浸出物、尿素、玉米漿和乙酸銨等,培養(yǎng)條件同上,分別測定其堿性磷酸酶活力。

1.2.7.3 不同pH對高產(chǎn)堿性磷酸酶菌株產(chǎn)酶活力的影響 選擇pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11、12,培養(yǎng)條件同上,觀察其生長并分別測定其堿性磷酸酶活力。

1.2.7.4 不同金屬離子對高產(chǎn)堿性磷酸酶菌株產(chǎn)酶的影響 以產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基為對照,研究鈣鹽對產(chǎn)堿性磷酸活性影響時,在無氯化鈣的堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入5 g/L的碳酸鈣和磷酸鈣等;研究鈉鹽對產(chǎn)堿性磷酸活性影響時,在無氯化鈉的堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.3 g/L的碳酸鈉、磷酸鈉、硫酸鈉和乙酸鈉;研究鉀鹽對產(chǎn)堿性磷酸活性影響時,在無氯化鉀的堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.3 g/L的碳酸鉀、磷酸鉀、硫酸鉀和乙酸鉀等,培養(yǎng)方式同上,分別測定其堿性磷酸酶活力。

1.2.8 響應(yīng)面實驗[20-24]為了確定最優(yōu)水平組合發(fā)酵培養(yǎng)基,利用中心組合實驗方法進行響應(yīng)面實驗設(shè)計。本實驗以果糖、尿素、pH和碳酸鈣四個因素的不同梯度為響應(yīng)變量,以堿性磷酸酶活性為響應(yīng)值,實驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 實驗因素水平設(shè)計表Table 1 Factors and levels in the combination design

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗設(shè)置三個平行,利用MEGA6系統(tǒng)發(fā)育樹分析,菌株復(fù)篩和單因素實驗結(jié)果用orign 8.5作圖,響應(yīng)面結(jié)果采用Design-Expert 8分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)磷酸酶菌株的分離與篩選

利用初篩方法對土壤樣品進行初步篩選,結(jié)果見表2。得到3株透明圈較好的菌株,即菌株S377-1、S377-10、S377-11,其D/d值分別為1.92、1.89和2.25。

表2 產(chǎn)堿性磷酸酶菌株初篩結(jié)果Table 2 Screening results of alkaline phosphatase-producing bacterium

將初篩到的3株菌株進行酶活力測定,結(jié)果如圖1所示。相對高產(chǎn)堿性磷酸酶的菌株為菌株S377-11,其酶活力達到(3900±25) U,將其編號為S377。

圖1 菌株S377-1、S377-10和S377-11 產(chǎn)堿性磷酸酶酶活力的比較Fig.1 Comparison of alkaline phosphatase activity in strains of S377-1,S377-10 and S377-11

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株菌落形態(tài)對比觀察 為更加直觀突出菌株S377在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上產(chǎn)酶優(yōu)勢采用菌株形態(tài)對比觀察法,如圖2。從圖2可知,3株產(chǎn)酶優(yōu)勢菌在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上均能較快生長,其中S377-10菌落最大,形成透明圈直徑較大,但透明圈與菌落直徑比值較小,且產(chǎn)生透明圈效果不顯著;S377-1也可以水解產(chǎn)酶培養(yǎng)基上的有機磷,但產(chǎn)生透明圈效果較弱;S377菌落大小適中,產(chǎn)生透明圈較大,透明圈與菌落直徑比值最大且產(chǎn)生透明圈效果顯著。同時觀察可知,S377在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上菌落呈圓形,表面粗糙、凸起,菌體表面微黃色。

圖2 產(chǎn)酶優(yōu)勢菌在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上菌落形態(tài)觀察Fig.2 The colonial morphology observation of enzyme production advantage bacterium on Enzyme production medium

2.2.2 生理生化鑒定 對菌株S377進行如下生理生化實驗,如表3。從表3可知菌種S377能夠利用D-葡萄糖、D-甘露醇、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和木D-糖產(chǎn)酸,其代謝產(chǎn)物能夠氧化乙醇和乙酸,能夠在GYC培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生透明圈,這些均說明該菌能夠產(chǎn)酸,但其氧化酶實驗、接觸酶實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、革蘭氏染色等均為陰性反應(yīng),說明S377可能是一株醋酸菌。

表3 S377菌株生理生化特性Table 3 Physical and biochemical characteristics of S377

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 提取S377菌株的基因組DNA。利用細菌16S rDNA通用引物進行擴增,獲得一條約1.5 kb的DNA序列(圖3)。

圖3 菌株S377基因組及16S rDNAFig.3 Genomic DNA and 16S rDNA of S377注:M表示1 kb DNA標(biāo)準(zhǔn)品。

通過菌株S377的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進行核苷酸同源性對比,構(gòu)建16S rDNA序列相似性系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4。由圖4可知,菌株S377與醋桿菌奧爾蘭亞種(Acetobacter orleanensis)同源性最高,同源性達到100%。因此,通過菌株菌落形態(tài)特征、生理生化特性及分子生物學(xué)等方面的鑒定,最終確定S377應(yīng)歸屬于厚壁菌門(Firmicutes)、梭菌綱(Clostridium)、優(yōu)桿菌科(Ubacterium)、醋酸桿菌屬(Acetobacter sp.)、醋桿菌奧爾蘭亞種(A.orleanensis)[25]。

圖4 菌株S377基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree for S377 based on 16S rDNA

2.3 不同環(huán)境因子對產(chǎn)酶活力的影響分析

2.3.1 碳源對產(chǎn)酶的影響 不同碳源對S377產(chǎn)堿性磷酸酶活力的影響結(jié)果如圖5所示。從圖5可知,以乳糖和木糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)S377產(chǎn)堿性磷酸酶活性均低于對照組;以果糖、麥芽糖和蔗糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)S377產(chǎn)堿性磷酸酶活性均高于對照組,其中以果糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基堿性磷酸活性最高,酶活力為(9100±130) U,大約是對照組的2.4倍。

圖5 碳源對菌株S377產(chǎn)堿性磷酸酶的影響Fig.5 Effect of carbon sources on the AKP production by strain S377

2.3.2 氮源對產(chǎn)酶的影響 不同氮源對S377產(chǎn)堿性磷酸酶活力的影響結(jié)果如圖6所示。從圖6可知,以氯化銨和酵母浸出物為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)S377產(chǎn)堿性磷酸酶活性均低于對照組;以尿素、乙酸銨、玉米漿和蛋白胨為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)S377產(chǎn)堿性磷酸酶活性均高于對照組,其中以尿素為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基堿性磷酸酶活性最高,酶活力為(12600±130) U,約為對照組的3.3倍。

圖6 氮源對菌株S377產(chǎn)堿性磷酸酶的影響Fig.6 Effect of nitrogen sources on the AKP production by strain S377

2.3.3 不同初始pH對產(chǎn)酶的影響 不同pH對S377產(chǎn)堿性磷酸酶活力的影響結(jié)果如圖7所示。從圖7可知,S377產(chǎn)堿性磷酸酶活力在堿性環(huán)境下相對較高,而在中性或酸性條件下酶活力相對較低,pH10酶活力達到(11800±195) U。一般來說,醋酸菌大多偏好酸性環(huán)境,而此菌株在堿性條件下也可正常生長,并分泌高活性的堿性磷酸酶,這有待做進一步的研究。

圖7 起始pH對菌株S377產(chǎn)堿性磷酸酶的影響Fig.7 Effect of initial pH on the AKP production by strain S377

2.3.4 不同金屬無機鹽離子對產(chǎn)酶的影響

2.3.4.1 鈣鹽對產(chǎn)酶的影響 不同鈣鹽對S377產(chǎn)堿性磷酸酶活力的影響結(jié)果如圖8所示。從圖8中可以看出,與對照組相比磷酸鈣對S377產(chǎn)堿性磷酸酶活力的影響不明顯,而碳酸鈣的影響則比較顯著,當(dāng)加入碳酸鈣時酶活力達到(11200±132) U,約為是對照組的3倍。

圖8 不同鈣鹽對菌株S377產(chǎn)堿性磷酸酶的影響Fig.8 Effect of calcium salt on the AKP productionby strain S377

2.3.4.2 鈉鹽對產(chǎn)酶的影響 不同鈉鹽對S377產(chǎn)堿性磷酸酶活力的影響結(jié)果如圖9所示。從圖9中可以看出,磷酸鈉、硫酸鈉和乙酸鈉對S377產(chǎn)堿性磷酸酶活力影響均低于對照組,僅碳酸鈉高于對照組,其酶活力為(5190±129) U,約為是對照組的1.4倍。

圖9 不同鈉鹽對菌株S377產(chǎn)堿性磷酸酶的影響Fig.9 Effect of sodium salt on the AKP production by strain S377

2.3.4.3 鉀鹽對產(chǎn)酶的影響 不同鉀鹽對S377產(chǎn)堿性磷酸酶活力的影響結(jié)果如圖10所示。從圖10中可以看出,磷酸鉀和硫酸鉀對S377產(chǎn)堿性磷酸酶活力影響均低于對照組;碳酸鉀和乙酸鉀高于對照組,其中碳酸鉀對產(chǎn)酶活力影響最高,酶活力為(6300±162) U,約為是對照組的1.6倍。

圖10 不同鉀鹽對菌株S377產(chǎn)堿性磷酸酶的影響Fig.10 Effect of potassium salt on the AKP production by strain S377

從上述結(jié)果可以看出,鈣鹽、鈉鹽或鉀鹽,均是以碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸鉀為培養(yǎng)基成份時產(chǎn)堿性磷酸酶活力最高,這與其pH越高,其活性越高有關(guān)。碳酸根離子在發(fā)酵過程中有可能起到酸堿緩沖作用。東方醋酸桿菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)酸,而碳酸根離子在此過程中可以中和部分酸,使得發(fā)酵液中的酸堿環(huán)境保持的相對穩(wěn)定的狀態(tài)下,從而堿性磷酸酶酶活力相對較高。但其具體作用機制有待進一步的研究。

2.4 響應(yīng)面實驗的優(yōu)化

總模型方差顯著(p<0.001),相關(guān)系數(shù)R2=0.9281,表明模型相關(guān)度較好;模型的失擬項不顯著(失擬項p值為0.0573>0.05),表明該模型精確度高,該模型的預(yù)測結(jié)果可以進行一定參考。各因素對S377堿性磷酸酶活力影響的次序為:尿素>pH>碳酸鈣>果糖。

對所得數(shù)據(jù)進行多元回歸分析,以堿性磷酸酶活力為Y,A為果糖,B為尿素,C為pH,D為碳酸鈣。得到四個因素與堿性磷酸酶活力之間的模擬方程為:

Y=20333.33-925A-1941.67B-1837.5C-1200.83D-303.75AB+222.5AC+356.25AD+697.5BC+506.25BD-525CD-1200A2-2400B2-1462.5C2-2591.25D2

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各實驗因子A、B、C、D所構(gòu)成的三維空間的曲面圖,從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出各因素之間的相互作用。根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖及相應(yīng)等值線圖結(jié)果見圖11。由圖11可較直觀地看出各因素對堿性磷酸酶存在一定的交互作用,各響應(yīng)值均有最優(yōu)的極值點。通過Design-Expert 8軟件進行系統(tǒng)優(yōu)化分析,得到最大響應(yīng)值的最佳配比條件為:果糖8.9 g/L,尿素0.4 g/L,pH9.2,碳酸鈣4.5 g/L,堿性磷酸酶活力的預(yù)測值為28335 U。利用此最優(yōu)培養(yǎng)基配方進行驗證,在30 ℃,200 r/min搖瓶發(fā)酵60 h 堿性磷酸酶活性達到(28600±65) U。與預(yù)測值之間偏差較小,因此預(yù)測結(jié)果較為可信。

表4 響應(yīng)面分析實驗結(jié)果Table 4 Response surface analysis test results

表5 以堿性磷酸酶活性為響應(yīng)值的二次多項模型的方差分析Table 5 ANOVA for the quadratic model with alkaline phosphatase as response value

圖11 各因素之間的等高線和響應(yīng)面圖Fig.11 The contour map and response graph between the various factors

3 結(jié)論

從土壤中篩選到一株高產(chǎn)堿性磷酸酶的菌株,經(jīng)菌落形態(tài)對比觀察、生理生化鑒定以及分子生物學(xué)鑒定,最終確定此菌株為醋桿菌奧爾蘭亞種(A.orleanensis),編號S377。在單因素實驗基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面實驗,發(fā)現(xiàn)果糖、尿素、碳酸鈣及pH對S377堿性磷酸酶活力影響顯著且相互之間存在一定交互作用,產(chǎn)堿性磷酸酶的影響次序為尿素>pH>碳酸鈣>果糖。通過系統(tǒng)優(yōu)化分析得到最佳發(fā)酵條件為:果糖(8.9 g/L)、尿素(0.4 g/L)、碳酸鈣(4.5 g/L)、pH(9.2),且在最優(yōu)條件下堿性磷酸酶活力達到(28600±65) U。