周 俊,夏秀東,李亞輝,王 英,董明盛,周劍忠,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014)

β-D-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase,EC 3.2.1.2 1)又稱纖維二糖酶,可以水解β-D-葡萄糖苷鍵,常作用于β-D-(1,4)、β-D-(1,6)、β-D-(1,2)、β-D-(1,3)鍵,是纖維素酶系中一種重要的水解酶。果酒香氣成分復雜,包含游離的揮發(fā)性風味物質(zhì)和大量以β-D-葡萄糖苷形式存在的非揮發(fā)性風味前體。β-D-葡萄糖苷酶可以催化風味前體糖苷配基(烴基或芳基)與糖基之間的糖苷鍵水解,從而產(chǎn)生芳香物質(zhì)達到增香效果[1-3]。β-D-葡萄糖苷酶在自然界中廣泛分布,其中植物來源的β-D-葡萄糖苷酶非常豐富,但活性低、不穩(wěn)定,且產(chǎn)量不高,因此微生物來源逐漸成為主要研究對象。曲霉來源的β-D-葡萄糖苷酶在葡萄酒中具有良好活性,因而被制成酶制劑用于增強果酒風味[4]。但由于曲霉在食品安全衛(wèi)生方面存在隱患,本文選擇具有高安全性的乳酸菌作為產(chǎn)酶菌株。

篩選高產(chǎn)菌株和檢測β-D-葡萄糖苷酶活的方法,通常歸納為分光光度法、熒光法、PNPG法、電化學法等。PNPG法靈敏度高且重現(xiàn)性好,是目前實驗室最常用的方法。然而該方法最主要的局限性在于色差不明顯,需要通過測定其水解產(chǎn)物的吸光度才能確定菌株的酶活性,對于進行大規(guī)模的菌株篩選而言,步驟繁瑣、成本太高[5]。選擇七葉苷顯色平板篩選產(chǎn)酶菌株,只需將待篩菌株劃接種于顯色平板,無需擴大培養(yǎng)即可通過顏色快速篩選出酶活性顯著的菌株,同時獲取單菌落,避免雜菌污染。

本文利用七葉苷顯色平板法明顯的色差對比,快速、高效地從實驗室保藏菌株中篩選出β-D-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株。以對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)為底物進行酶活初步定位,驗證菌株酶活的同時,確定菌株產(chǎn)酶的主要部位[6-7]。利用生理生化實驗、糖發(fā)酵實驗和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹對菌株進行鑒定,并分析菌株的遺傳多樣性[8],為后續(xù)應用于果酒增香提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

63株待篩選乳酸菌 于江蘇省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工所226實驗室-20 ℃冰箱保存。

過氧化氫、蛋白胨、酵母提取物、鹽酸、氫氧化鈉、明膠、半胱氨酸、乙酸鉛試紙以及各種糖化合物水解實驗材料 南京壽徳有限公司;基因組提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;Taq DNA聚合酶 TaKaRa公司;DNA Maker,瓊脂糖,PCR引物合成,基因測序 北京擎科生物技術有限公司;Goldview I型核酸染色劑 北京索萊寶科技有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 Axygen公司。

DSX-280B型式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療;AG PB-10型pH計 德國Sartorius;SW-CJ-2G型超凈工作臺、LRH-150型生化培養(yǎng)箱 蘇州凈化設備;DHG-9146A型電熱鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備;3K15型高速冷凍離心機 美國Sigma;WH-3型漩渦混合儀 上海躍進醫(yī)療;PCR儀,PRO-3型垂直平板電泳儀,GelDocEQ型凝膠成像儀 BIO-RAD公司;超純水機 力康HealForce公司;制冰機IMS-40 常熟市雪科電器;恒溫水浴鍋 常州國華;分光光度計One Drop OD-2000 南京五義科技;全溫振蕩器THZ-C-1 太倉市實驗設備;分析電子天平FA2004 上海良平儀器儀表;超聲波細胞破碎儀 南京先歐儀器。

MRS液體培養(yǎng)基:牛肉膏10 g/L,、酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、乙酸5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸二氨2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L、吐溫80 1 mL/L。調(diào)節(jié)pH至7.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。主要用于乳酸菌的活化和培養(yǎng)。

MRS固體培養(yǎng)基:在MRS液體培養(yǎng)基的基礎上添加1.8%的瓊脂,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。主要用于乳酸菌的分離和純化。

七葉苷顯色平板:在MRS固體培養(yǎng)基上添加0.5%的七葉苷和0.025%的檸檬酸鐵,主要用于篩選產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的乳酸菌。

1.2 實驗方法

1.2.1 七葉苷顯色平板篩選法產(chǎn)酶菌的篩選 具有β-D-葡萄糖苷酶活性的菌株能夠水解底物七葉苷(6,7-2-羥基-香豆素-β-D-葡萄糖苷),其產(chǎn)物七葉素(6,7-2-羥基-香豆素)與檸檬酸鐵中的三價鐵離子反應能產(chǎn)生棕黑色物質(zhì),形成明顯的色差便于肉眼觀察,極大提高了分離工作的效率[7]。

將63株乳酸菌分別劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基上,置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h,挑取單菌落將其接種于七葉苷顯色平板培養(yǎng)基上,置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h后觀察其顏色變化,若在菌落周圍出現(xiàn)了棕黑色物質(zhì),則表明該菌株具有β-D-葡萄糖苷酶活性[9-10]。

1.2.2β-D-葡萄糖苷酶的初步定位研究 根據(jù)酶在生物體內(nèi)存在的部分,可分為胞內(nèi)酶和胞外酶。胞外酶作用于細胞外,利用離心方法即可獲得;而胞內(nèi)酶作用于細胞內(nèi),需破碎細胞后獲取。對比菌株各個組分的酶活,可確定β-D-葡萄糖苷酶在細胞中的存在部位,為后續(xù)獲取目的蛋白酶采取何種純化方案提供了理論基礎。

對1.2.1中篩選出的產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的菌株進行其產(chǎn)酶部位的定位。β-D-葡萄糖苷酶的初步定位研究參照相關文獻[11],結合實驗室條件參數(shù)調(diào)整如下:選取平板顏色有明顯變化的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)18 h,取30 mL菌液冷凍離心(8000 g,4 ℃10 min)得菌體及菌液上清液,取1 mL菌液上清液用于酶活性測定,菌體用0.85% NaCl溶液(w/V)洗滌兩遍,然后懸浮于30 mL PBS 1×buffer(KCl 2.7 mmol/L;NaCl 140 mmol/L;Na2HPO410 mmol/L;KH2PO41.8 mmol/L,pH7.4)。取1 mL菌體懸浮液(作為完整細胞)用于酶活性測定,向剩余菌液中加入溶菌酶(1 mg/mL),并于37 ℃孵育1 h后在冰浴條件下用超聲波細胞粉碎機破碎20 min(功率25%,超聲1 s,間停3 s),取1 mL細胞破碎液直接用于酶活性測定,另取10 mL破碎液離心(8000×g,4 ℃,10 min),得破碎上清液和細胞碎片。取1 mL破碎上清液直接用作酶活性測定。細胞碎片用0.85% NaCl溶液洗滌兩次,然后懸浮于10 mL PBS 1×buffer溶液中,取1 mL菌體懸浮液(作為細胞碎片)用作酶活性測定。經(jīng)過上述實驗步驟,總共獲得5個樣品:菌液上清、完整細胞、細胞破碎液、破碎上清和細胞碎片。最后按照以下酶活性測定方法對樣品進行酶活性測定,所有樣品重復測定三次。

實驗中改進了Grimaldi等[4]所用的β-D-葡萄糖苷酶活性測定方法,反應在96孔板中進行反應,并使用酶標儀測定吸光值。反應體系(80 μL)包括:50 μL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L 檸檬酸,0.2 mol/L K2HPO4,pH4.5),10 μL 20 mmol/L PNPG溶液,20 μL菌液,于37 ℃培養(yǎng)箱中反應30 min后,立即加入120 μL的1 mol/L Na2CO3溶液終止反應,混勻后靜置一會,于405 nm下測定吸光值(OD),測定3個重復?？瞻讓φ諡槲醇尤肴樗峋姆磻w系,陰性對照為用無菌水代替PNPG溶液,其他處理相同。

1.2.3 產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌的鑒定

1.2.3.1 菌體形態(tài)和生理生化實驗 將 1.2.1中篩選出的產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的菌株接種于MRS瓊脂平板上,置于37 ℃培養(yǎng)18 h,觀察菌落形態(tài),并進行革蘭氏染色后觀察菌體形態(tài)。各項生理生化實驗指標參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[12]、《乳酸菌:生物學基礎及應用》[13]及《伯杰細菌鑒定手冊》[14]。凡革蘭氏染色呈陽性,過氧化氫酶實驗、硫化氫產(chǎn)生實驗為陰性且在pH4.5條件下可以生長的桿狀無內(nèi)生芽孢菌株可初步認定為是乳桿菌。再進行其他生理生化實驗:明膠液化實驗、吲哚實驗和硝酸鹽還原實驗證是否符合乳桿菌屬的生物特性。根據(jù)菌種對單糖、多糖以及糖醇類等碳水化合物的利用情況可以粗略劃分乳桿菌種[15],若出現(xiàn)與發(fā)酵群種的生理生化特征相矛盾的情況可增補其他鑒別特征:所產(chǎn)乳酸的異構體、肽聚糖類型等。

1.2.3.2 16S rDNA PCR 將篩選得到的具有β-D-葡萄糖甘酶活性的菌株接種于液體MRS培養(yǎng)基中,培養(yǎng)16～18 h至對數(shù)期后制成乳酸菌菌體懸浮液,按照細菌基因組提取試劑盒操作說明提取菌株的基因組DNA。將提取得到的基因組DNA溶液用One Drop OD-2000和瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,測定其OD260、OD280及其比值[16],以確定DNA濃度和純度是否達到后續(xù)實驗要求。剩余DNA溶液放置于-20 ℃冰箱凍藏。

以提取得到的基因組DNA作為PCR擴增的模板。反應體系為50 μL,擴增反應體系見表1。PCR擴增反應條件:98 ℃預變性5 min,98 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共進行30個循環(huán),最后在72 ℃下延伸10 min。將PCR擴增后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,電壓為120 V,電泳結束后用凝膠成像儀觀察條帶,將觀察到的目的條帶進行切膠處理,用DNA膠回收試劑盒進行切膠回收,并由北京擎科生物股份有限公司完成測序。

表1 16S rDNA PCR擴增體系Table 1 PCR amplification system of 16S rDNA PCR

1.2.3.3 16S rDNA序列同源性分析 用DNAStar軟件的SeqMan對測序結果進行雙向拼接后,通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)對篩選菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列進行分析和確定。一般來講,在種分類等級上,如果2個分類單位間的16S rDNA序列同源性大于97.5%,則認為屬于同一個種[17]。根據(jù)序列同源性在標準菌株網(wǎng)站(http://www.straininfo.net/)中選取不同的模式菌株,使用MEGA 5.0軟件將模式菌株序列、Blast獲取的高同源性菌株序列以及測定菌株序列以Clustal W方法進行多序列比對。刪除兩端未對齊的堿基,使用NJ法[18]構建進化樹,采用自舉分析進行置信度檢測,自舉數(shù)據(jù)集為1000次[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和Prism 7軟件進行數(shù)據(jù)處理及作圖分析。

2 結果與分析

2.1 平板篩選

為凸顯顏色差異,選擇將具有活性的與部分無活性菌株重新接種于同一塊顯色平板上,結果如圖1所示。從篩選結果可以看出,編號為CM3、Hsb、FL12、T61的菌株具有β-D-葡萄糖苷酶活性,且根據(jù)平板顏色的深淺,可以初步判定菌株T61的酶活最高,菌株CM3、Hsb、FL12的酶活接近。相比于從平板中挑取單菌落擴大培養(yǎng)再測定酶活的方法,七葉苷顯色平板法避免了繁瑣的實驗步驟,而且靈敏度高,重現(xiàn)性好,是大規(guī)模篩選產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶菌株的優(yōu)先選擇[20]。

圖1 七葉苷顯色平板篩選結果Fig.1 Detection of enzymes on the Esculin color-developing plate

2.2 β-D-葡萄糖苷酶的初步定位

設定CM3的完整細胞為最高酶活100%,計算其他組分的相對酶活。圖2為4株菌株所產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶初步定位的結果。有下圖可知,4株菌均具有β-D-葡萄糖苷酶活性,其中T61的酶活明顯要低于其他菌株,這與七葉苷顯色平板法的結果相矛盾。對比4個菌株培養(yǎng)基的菌液濁度可知,菌株T61的菌體濃度明顯低于其他菌株,對比該菌株在MRS固體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài),推測該菌株為兼性厭氧型菌株,前期有氧條件可以促進生長,后期生長需要盡量保持低氧環(huán)境。

圖2 β-D-葡萄糖苷酶的初步定位Fig.2 β-glucosidase activity of different fractions from four strains

菌株CM3、FL12、Hsb各組分的酶活情況相似:菌液上清幾乎無酶活,而完整細胞具有酶活,說明菌株所產(chǎn)的β-D-葡萄糖苷酶并沒有分泌到細胞外,屬于胞內(nèi)酶[21]。完整細胞和破碎菌液酶活相接近,說明細胞破碎并不會顯著影響酶活性。破碎上清(可溶性酶)無酶活而細胞碎片(細胞膜部分)約保留40%～60%酶活性,推測細胞中含有某些物質(zhì)能促進酶催化反應,因而細胞碎片酶活降低。并且菌株所產(chǎn)的β-D-葡萄糖苷酶與細胞膜緊密結合,形成不可溶狀態(tài)。

雖然這與大部分胞外及胞內(nèi)β-D-葡萄糖苷酶的研究結果存在差異[22-24],但仍有前人報道過類似情況[23]。產(chǎn)生這種情況的原因可能與酶的結構和特性有關。目的蛋白酶與細胞膜結合的特性,使得無法通過硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析等傳統(tǒng)純化方式獲得純酶。除了考慮表面活性劑等材質(zhì)處理目標蛋白酶,還可以通過修飾目的基因片段,添加標簽,將目的蛋白通過外源表達方式獲取[5,25]。

2.3 產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學觀察 菌株菌落形態(tài)基本相似,為生長狀況良好、邊緣光滑整齊、乳白色、凸起的圓形菌。T61的菌落為灰白色,中間有深色突起的褐色小點。4株菌經(jīng)染色后,在油鏡下觀察均呈現(xiàn)藍紫色,為革蘭氏染色陽性菌,無芽孢、無鞭毛。細胞形態(tài)都為桿狀,有長桿短桿,短桿菌成單個或成對出現(xiàn),一般形成鏈。符合乳桿菌的形態(tài)特征。

2.3.2 生理生化實驗 將選出的4株疑似乳桿菌菌株進行一系列生理生化鑒定實驗,結果如表2所示。4株菌株均為過氧化氫酶實驗陰性、硫化氫實驗陰性、明膠液化陰性、硝酸鹽還原陰性。在耐酸堿實驗中,pH4.5時,菌株都能生長,表明菌株CM3、Hsb、FL12、T61都耐酸,T61在pH為2.5時仍能生長,可見耐酸性能最強。隨著生長環(huán)境pH的升高菌種生長狀況逐漸變好,在pH6.5時長勢最好,在中性或初始堿性pH條件時,生長情況開始下降[8,26]。篩選獲取的4株菌株初步判斷為乳桿菌。

表2 生理生化實驗結果Table 2 Physiological and biochemical result of the strains

糖類發(fā)酵實驗可劃分菌種,由表3可知,CM3、Hsb、FL12菌株生長情況相近,利用多糖的情況基本相同,T61菌株利用木糖和甘露糖的能力不是很強,不能利用海藻糖和棉籽糖。將生理生化、糖發(fā)酵結果與《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》中乳桿菌的特征對照,基本符合乳桿菌的理化特性。

表3 糖發(fā)酵實驗結果Table 3 Results of sugar fermentation

2.3.3 16S rDNA序列分析及鑒定結果 用One Drop OD-2000和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測CM3、Hsb、FL12、T61菌株提取的基因組DNA。確保各菌株提取的基因組DNA純度較高,符合PCR擴增的要求。再將經(jīng)過16S rDNA擴增后的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳對其進行電泳檢測,在大約1500 bp處獲得熒光條帶(圖3),且電泳圖無雜帶確保其完整性。

圖3 乳酸菌16Sr DNA片段PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR amplified products of 16S rDNA fragment注:1.CM3;2.Hsb;3.FL12;4.T61。

在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST軟件對測序結果進行同源性分析,結果見表4。CM3菌株和戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)同源性最高,Hsb、FL12菌株和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)同源性最高,T61菌株和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)同源性最高。所有菌種的同源性、覆蓋率均達到99%以上,E值都為0.0。

表4 菌株的16S rDNA序列同源性比對結果Table 4 Homologous alignment analysis of 16S rDNA sequences from isolates

2.3.4 16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹 以4株乳酸菌測序后拼接的序列、與其高同源性菌株序列以及標準菌株序列為對象,構建進化樹。

如圖4所示,系統(tǒng)發(fā)育樹呈現(xiàn)3個較大分支。其中CM3、Hsb和FL12處于一個較大分支,Hsb、FL12和植物乳桿菌模式菌株(L.plantarumAB830324.1)自聚為一小分支,CM3與戊糖乳桿菌模式菌株(L.pentosusD79211.1)處于一個大分支;T61和短乳桿菌模式菌株(L.brevisEU194349.1)處于另一個大分支。一般來說,如果低自展值靠近分支末端,可能是由于相似度太高難以區(qū)分;如果低自展值靠近根,可能是由于相似度太低[27]。系統(tǒng)發(fā)育樹各分支自展值均高于50,其分支結構符合上表4序列同源性比對結果,綜合所有實驗數(shù)據(jù)可以判定:Hsb和FL12為植物乳桿菌,CM3為戊糖乳桿菌,T61為短乳桿菌。同時因為各個菌株的親緣關系與它們在進化樹中的距離呈正比,表明戊糖乳桿菌和植物乳桿菌的親緣關系較近。

圖4 基于16S rDNA序列對乳酸桿菌進行構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree for lactic acid bacteria based on their 16S rDNA sequences

3 結論

以實驗室保藏的63株菌為對象,通過七葉苷顯色平板法共篩出4株可高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的乳酸菌疑似菌株。通過酶定位實驗,確定了菌株所產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶,并且超聲破碎后上清不存在活性,不利于天然蛋白的純化。通過鏡檢、過氧化氫酶實驗初步判定為乳酸菌菌株,再通過生理生化實驗、糖發(fā)酵實驗進一步驗證,推測4株菌株都為乳桿菌,對其進行測序、同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建,4株代表性菌株中,FL12、Hsb為植物乳桿菌(Lactobacilluspentosus),CM3為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus),T61為短乳桿菌(Lactobacilluspentosus)。

由于無法通過收集破碎上清液的方式獲取純酶,后續(xù)研究將嘗試使用分子生物學技術對β-D-葡萄糖苷酶基因進行克隆、表達純化,以探究乳酸菌來源的β-D-葡萄糖苷酶對風味物質(zhì)的影響。