陳 佩,黨 輝,郭紅軍,翟彩寧

(1.陜西廣播電視大學(xué),益生菌功能及應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西西安 710062;2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

正常狀態(tài)下,人體中自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài),但由于種種原因?qū)е聶C(jī)體自由基產(chǎn)量升高或者機(jī)體清除自由基的能力下降時,機(jī)體就會出現(xiàn)氧化應(yīng)激,這種狀態(tài)會使機(jī)體受到一定的損傷,引發(fā)機(jī)體功能障礙,可導(dǎo)致腸道組織損傷[1],動脈粥樣硬化[2]、肝病[3]、糖尿病和癌癥[4]等疾病的發(fā)生。目前,可通過抗氧化劑來清除活性氧,但是人工合成的抗氧化劑大多數(shù)為芳胺類或苯酚類,均具有一定的毒性,長期使用會給機(jī)體帶來一系列的副作用,例如對肝、脾和肺均有不利的影響[5-6]。因此尋求更為安全天然的抗氧化劑是非常必要的[7]。

乳酸菌是一類能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生主要終產(chǎn)物為乳酸的革蘭氏陽性菌,在自然界分布廣泛,具有調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)[8]、調(diào)節(jié)免疫力[9]、降低血糖[10]和延緩衰老[11]等功能,是公認(rèn)的安全級微生物[12],被廣泛地應(yīng)用于食品生產(chǎn)工業(yè)和發(fā)酵領(lǐng)域。近年來,乳酸菌在體內(nèi)外的抗氧化能力得到了廣泛的研究。劉宏宇等[13]對25株乳酸菌進(jìn)行體外抗氧化研究發(fā)現(xiàn)不同來源乳酸菌的抗氧化活性存在種間和種內(nèi)差異。Ji等[14]從奶牛糞便中分離出四種乳酸菌,經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)都具有很好的抗氧化活性,可用于開發(fā)抗氧化劑。余芳等[15]從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到10株乳酸菌,發(fā)現(xiàn)其都具有一定的抗氧化活性。

本研究以前期從陜南泡菜中篩選出的一株高產(chǎn)胞外多糖的戊糖片球菌P36為研究對象[16],擬通過H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷模型對乳酸菌抗氧化能力進(jìn)行評價,研究該菌株對HepG2細(xì)胞抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

戊糖片球菌P36 分離自陜南地區(qū)農(nóng)戶自制泡菜;人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞株 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 美國sigma公司;DMEM低糖培養(yǎng)基、雙抗(青、鏈霉素)、0.25%胰酶(含0.02% EDTA)、胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA) 美國Gibico公司;MRS液體培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司。

LRH-150型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;HEPA Class 100型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;SW-CJ-1CV超凈臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;5415R 冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;VCX500超聲波破碎儀 美國Sonics公司;UV-2450紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;CX41-12C02倒置顯微鏡 日本Olympus公司;DM2000型熒光顯微鏡 德國Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌菌種的培養(yǎng) 將凍存于-80 ℃的乳酸菌接入MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h,連續(xù)活化三代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 乳酸菌的菌液制備 將培養(yǎng)好的乳酸菌在4 ℃條件下,以6000 r/min離心10 min,棄上清液,菌體用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)離心洗滌3次,菌液濃度調(diào)節(jié)為1×109CFU/mL。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞按常規(guī)方法復(fù)蘇后,置于含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸(NEAA)、1% L-谷氨酰胺和1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液中,37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),隔天更換一次培養(yǎng)液,待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)80%左右時,用含0.02% EDTA 的0.25%胰酶消化細(xì)胞,按1∶3傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 H2O2對HepG2細(xì)胞氧化損傷模型的建立 參照文獻(xiàn)[17]的方法有所改動,將對數(shù)生長期中的HepG2細(xì)胞按照2×105個/mL接種到96孔板中,每孔100 μL,37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,加入100 μL含H2O2終濃度為0.10 mmol/L的DMEM培養(yǎng)液,作用2 h,以此建立氧化損傷模型。

1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞存活率 參照文獻(xiàn)[18]的方法有所改動,96孔板中每孔加入5 g/L 的MTT 40 μL,置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,孵育4 h,吸出培養(yǎng)液,每孔加入150 μL的DMSO溶解結(jié)晶,37 ℃培養(yǎng)箱中放置10 min,確保紫色結(jié)晶充分溶解,振蕩混勻后,酶標(biāo)儀測定各孔在570 nm處的吸光度值。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率:

細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A570/對照組A570)×100

1.2.6 實(shí)驗(yàn)分組 參照文獻(xiàn)[19]的方法有所改動,用0.25%的胰酶消化收集生長處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞,以2×105個/mL的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板,每孔2 mL培養(yǎng)液,置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h后,分組處理:空白對照組,加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)液;模型組,加入2 mL含H2O2的DMEM培養(yǎng)液;乳酸菌組,同時加入含H2O2的DMEM培養(yǎng)液和戊糖片球菌P36(1×109CFU/mL)2 mL,繼續(xù)培養(yǎng)12和24 h。

1.2.7 樣品收集 細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12和24 h后吸取培養(yǎng)上清液裝入離心管,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｃ靠子肞BS(pH7.2)洗滌3次,然后每孔加1 mL 1%的Triton X-100用吸管充分吹勻,2000 r/min 離心15 min,收集上清即為細(xì)胞裂解液,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 指標(biāo)測定 T-AOC、SOD、GSH、GSH-Px、CAT、POD、LDH和MDA指標(biāo)測定方法均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.9 細(xì)胞形態(tài)觀察 參照文獻(xiàn)[20]的方法有所改動,將HepG2細(xì)胞以2×105個/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h使細(xì)胞爬片,后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(造模及乳酸菌處理),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,PBS(pH7.2)洗滌3次,避光加入DAPI工作液(1 μg/mL)淹沒平皿底部,染色20 min后,PBS(pH7.2)漂洗3次后封片,避光用熒光顯微鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0進(jìn)行one-way ANOVA,Tukey’s多重檢驗(yàn)(p<0.05),數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 戊糖片球菌P36對HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液抗氧化能力的影響

從表1可以看出,12 h時,與對照組相比,模型組細(xì)胞上清液中的GSH-Px的活力顯著增加了74.24%(p<0.05),POD活力顯著降低24.38%(p<0.05),SOD、GSH、CAT和MDA的含量無顯著性差異(p>0.05),表明此時模型組細(xì)胞還未進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)。與模型組相比,添加戊糖片球菌P36 12 h后,細(xì)胞上清液中的T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT活力都有顯著提高,分別顯著提高了58.78%、22.63%、27.59%和125.93%(p<0.05),POD的活力顯著降低了44.10%(p<0.05),MDA含量增加了19.05%,此與崔志文等[21]研究結(jié)果一致,表明戊糖片球菌P36可以提高細(xì)胞抗氧化能力,但是對細(xì)胞也有一定的刺激作用。24 h后,與對照組相比,模型組細(xì)胞上清液中的T-AOC顯著降低了43.41%(p<0.05),SOD、GSH-Px和CAT的活力分別顯著降低11.43%、51.85%和46.86%(p<0.05),同時POD活力顯著增加32.22%(p<0.05),MDA含量顯著增加80.93%(p<0.05),表明此時細(xì)胞已表現(xiàn)為氧化應(yīng)激狀態(tài)。與模型組相比,添加戊糖片球菌P36 24 h后,細(xì)胞上清液中的T-AOC和SOD的活力顯著增加了145.34%和122.54%(p<0.05),GSH-Px、CAT和POD的活力顯著增加(p<0.05),GSH和MDA的含量分別顯著降低了27.71%和49.43%(p<0.05)。王玉華等[22]研究表明鼠李糖乳桿菌具有高效清除羥自由基和超氧化陰離子自由基的能力,其抗氧化作用的活性成分可能與活細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)活性成分有關(guān)。Kullisaar 等[23]研究表明益生菌發(fā)酵的山羊乳可以提高人體SOD和GSH-Px活力,降低腸道氧化應(yīng)激,增強(qiáng)抗氧化能力。

表1 細(xì)胞上清液在12和24 h時的抗氧化活性Table 1 Antioxidative activities of cells supernatant at 12 and 24 h

綜上所述,P36提高了抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT和POD的合成和分泌效率,增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化能力。

2.2 戊糖片球菌P36對HepG2細(xì)胞裂解液抗氧化活性的影響

由表2可知,12 h后,與對照組相比,模型組細(xì)胞裂解液中SOD活力含量有所降低,但差異不顯著(p>0.05),GSH含量顯著降低(p<0.05),POD的活力顯著提高了92.34%(p<0.05)。結(jié)果表明此時細(xì)胞剛開始受到刺激,胞內(nèi)POD活力增加以保護(hù)細(xì)胞免受損傷。添加戊糖片球菌P36 12 h后,乳酸菌組的細(xì)胞裂解液中SOD活力與對照組和模型組相比分別顯著增加了14.32%和17.49%(p<0.05);POD的活力與對照組相比顯著增加了101.62%(p<0.05),和模型組相比也有所增加;GSH的含量與模型組相比顯著增加(p<0.05)。表明此時細(xì)胞受到乳酸菌的氧化刺激作用,胞內(nèi)的氧化酶含量隨之升高。24 h后,與對照組相比,模型組細(xì)胞裂解液中的SOD活力和GSH含量分別顯著增加了43.79%和60.81%(p<0.05);POD活力也有所增加。

表2 細(xì)胞裂解液在12和24 h時的抗氧化活性Table 2 Antioxidative activities of cells lysate at 12 and 24 h

添加戊糖片球菌P36組的SOD活力比對照組有所增加,但比模型組顯著降低了19.76%(p<0.05);POD活力比對照組和模型組分別顯著增加了114.46%和93.63%(p<0.05);GSH含量比對照組顯著增加了72.01%(p<0.05),與模型組相比也有所增加。

綜上所述,此時模型組的細(xì)胞已受到強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激,細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物SOD開始大量合成,以保護(hù)細(xì)胞免受損傷。另外,戊糖片球菌P36通過刺激提高細(xì)胞內(nèi)POD的活力,增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化作用,對細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。有研究表明植物乳桿菌可以提高Caco-2細(xì)胞的抗氧化酶活性,具有很強(qiáng)的抗氧化活性[24],本研究與此結(jié)果一致。

2.3 戊糖片球菌P36對HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

DAPI是一種熒光染料,它可以穿透完整的細(xì)胞膜,與細(xì)胞內(nèi)的DNA強(qiáng)力結(jié)合,在熒光顯微鏡下觀測呈現(xiàn)藍(lán)色至青綠色。如圖1所示,HepG2細(xì)胞經(jīng)過不同處理后,再進(jìn)行DAPI染色,在熒光顯微鏡下可以明顯看出其細(xì)胞形態(tài)的變化情況。圖1A顯示正常HepG2細(xì)胞的核DNA與DAPI特異性結(jié)合后,細(xì)胞核的輪廓清晰可見,呈圓形或橢圓形,核內(nèi)呈現(xiàn)均勻彌漫的熒光,細(xì)胞質(zhì)無熒光。圖1B所示,經(jīng)過H2O2損傷后的HepG2細(xì)胞形態(tài)明顯改變,細(xì)胞核皺縮,體積變小呈不規(guī)則形狀,核內(nèi)呈現(xiàn)致密濃染的塊狀凝聚強(qiáng)熒光。圖1C所示,加入戊糖片球菌P36后,細(xì)胞受損程度明顯低于圖1B中模型組細(xì)胞,少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡,其細(xì)胞核皺縮,體積變小,但大部分細(xì)胞形態(tài)正常,呈現(xiàn)均勻彌漫的熒光。此結(jié)果與上文結(jié)果相符,即反映出戊糖片球菌P36具有抗氧化的能力,能夠減少H2O2對HepG2細(xì)胞的損傷。

圖1 熒光顯微鏡下HepG2細(xì)胞核形態(tài)(400×)Fig.1 Morphology of nucleus in HepG2 cells with fluorescence microscope(400×)注:A:正常組；B:模型組；C:乳酸菌組。

3 結(jié)論

本文對一株高產(chǎn)胞外多糖的戊糖片球菌P36對HepG2細(xì)胞的抗氧化能力進(jìn)行了研究。將HepG2細(xì)胞分為空白對照組、模型組和乳酸菌組。細(xì)胞培養(yǎng)至12和24 h時分別測定其上清液和細(xì)胞裂解液的抗氧化活性。并利用DAPI對HepG2細(xì)胞進(jìn)行染色后觀測不同組細(xì)胞核形態(tài)的變化。結(jié)果表明,戊糖片球菌P36與經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后表現(xiàn)出一定的抗氧化作用。細(xì)胞上清液中的抗氧化酶活力均顯著增加(p<0.05),GSH和MDA的含量均顯著降低(p<0.05),細(xì)胞裂解液中的SOD活力顯著降低(p<0.05)。因此,戊糖片球菌P36能夠明顯減輕H2O2對細(xì)胞的氧化損傷,使HepG2細(xì)胞受損程度降低。為了更深入探討戊糖片球菌P36的抗氧化能力,后續(xù)將進(jìn)一步開展相應(yīng)的動物實(shí)驗(yàn)研究。