王丹丹,毛曉英,孫領(lǐng)鴿,田洪磊,詹 萍

(石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000)

蛋白質(zhì)氧化的概念最初起源于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,是指在自由基及相關(guān)氧化產(chǎn)物的作用下,血漿或組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)中某些特定的氨基酸殘基被氧化,導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使蛋白質(zhì)與氧化物之間的親和力增強(qiáng),蛋白質(zhì)易發(fā)生聚合、水解和交聯(lián),最終導(dǎo)致細(xì)胞功能損害直至細(xì)胞死亡的現(xiàn)象[1]。后來(lái),蛋白質(zhì)氧化這一概念被引入食品領(lǐng)域,目前已逐漸成為食品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。在食品領(lǐng)域中,蛋白質(zhì)氧化是指活性氧(ROS)在直接作用或間接作用下氧化蛋白質(zhì)分子,而導(dǎo)致蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)修飾,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能特性下降、風(fēng)味惡化以及營(yíng)養(yǎng)損失的現(xiàn)象[2]。因此,食品中蛋白質(zhì)氧化的研究,對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量、保護(hù)人體健康方面具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[3]。

在正常的食品加工過(guò)程中,導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化主要因素是ROS誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化和加速非酶糖基化,再利用其活性中間產(chǎn)物間接介導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化,其過(guò)程中LOX(脂肪氧合酶)是氧化的關(guān)鍵因素。此外,蛋白質(zhì)在自由基的作用下,可發(fā)生包括脂質(zhì)過(guò)氧化化合物的生成、二硫鍵的連接、酪氨酸側(cè)鏈的硝基化和氨基酸的羰基化等一系列共價(jià)修飾作用[4]。與動(dòng)物性原料相比,植物性食品原料,如大豆、核桃中的脂肪氧合酶(LOX)活性較高。無(wú)論是在榨油的過(guò)程中,還是在大豆蛋白、核桃蛋白的制備過(guò)程中,始終存在LOX誘導(dǎo)多不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化的應(yīng)激環(huán)境。在此環(huán)境中產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基、脂質(zhì)氫過(guò)氧化物及活性次生氧化產(chǎn)物均能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化。前期研究人員對(duì)大豆蛋白、花生蛋白的脂質(zhì)自由基氧化進(jìn)行了探索[4-7]。核桃蛋白質(zhì)是一種優(yōu)良的植物蛋白質(zhì)資源,且氨基酸比例較合理,是一種營(yíng)養(yǎng)平衡的植物蛋白,具有很好的開(kāi)發(fā)價(jià)值[8]。由于核桃及核桃蛋白產(chǎn)品始終存在LOX誘導(dǎo)多不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化的應(yīng)激環(huán)境,從而導(dǎo)致核桃蛋白的結(jié)構(gòu)及功能性發(fā)生改變,從而影響了核桃及蛋白產(chǎn)品的品質(zhì)。

目前,關(guān)于核桃蛋白質(zhì)氧化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,為了深入明晰氧化促使核桃蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)性修飾的機(jī)理,本文以核桃分離蛋白為研究對(duì)象,采用2,2′-鹽酸脒基丙烷(AAPH)熱降解形成的過(guò)氧自由基代表脂質(zhì)自由基,建立過(guò)氧自由基-核桃分離蛋白氧化體系,以期在分子水平上對(duì)核桃蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)性氧化修飾的機(jī)理進(jìn)行探索和研究,為核桃蛋白產(chǎn)品在加工及儲(chǔ)藏過(guò)程中品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薄皮核桃 新疆石河子農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)(和田產(chǎn));5,5-二硫代二硝基苯甲酸、1-苯氨基萘-8-磺酸 上海源葉生物科技有限公司;三氯乙酸(TCA) 天津永晟精細(xì)化工有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 上海金錦樂(lè)實(shí)業(yè)有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS) 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;牛血清蛋白(67000 Da) 上海金穗生物科技有限公司;甲狀腺球蛋白(669000 Da)、醛縮酶(158000 Da)、過(guò)氧化物酶(40200 Da)、腺苷酸激酶(32000 Da)、肌紅蛋白(17000 Da)、核糖核酸酶(13700 Da)、抑肽酶(6500 Da)、維生素B12(1350 Da) 上海一基實(shí)業(yè)有限公司;卵清蛋白(43000 Da) 北京索萊寶科技有限公司;其它試劑均為分析純。

LGJ-18S冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技有限公司;23R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 力康發(fā)展有限公司;MOS450圓二色光譜儀 法國(guó)Bio-Logic;F-7000 熒光光譜儀 日本日立公司;Water 2690型液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 核桃分離蛋白的制備 參照毛曉英的方法[9],核桃仁用2% NaOH溶液在室溫下浸泡4 min,后手動(dòng)去皮、用中草藥粉碎機(jī)粉碎,采用正己烷以 1∶5 (w/v)的料液比脫脂1 h,抽濾,收集殘?jiān)龠M(jìn)行提取,以濾液為無(wú)色透明時(shí),收集殘?jiān)?置于通風(fēng)櫥揮干正己烷溶劑。將殘?jiān)梅鬯闄C(jī)粉碎后過(guò)80目篩,即得到核桃脫脂粉。將核桃脫脂粉用95%乙醇醇洗(1∶10,w/v)一次,以除去剩余的油脂,揮干乙醇溶劑。按照1∶26 (w/v)料液比加入去離子水溶解,用0.2 mmol/L的NaOH調(diào)節(jié)蛋白溶液pH11,室溫下攪拌1.5 h,然后在室溫下離心(4000×g,15 min),取上清液,用0.2 mmol/L的HCl調(diào)節(jié)上清液pH4.5,磁力攪拌1 h,室溫下離心(8000×g,15 min),取沉淀,用去離子水調(diào)節(jié)至中性,最后冷凍干燥,得到核桃分離蛋白,至于4 ℃貯藏備用。

1.2.2 核桃氧化蛋白的制備 參照Huang[6]的方法,將制備的核桃分離蛋白(10 mg/mL)溶解于0.01 mol/L pH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中(含NaN3濃度為0.5 mg/mL)。將一定量的AAPH與核桃蛋白溶液混合,使AAPH的最終濃度分別為0、0.04、0.2、1、5和25 mmol/L,25 ℃密封避光條件下振蕩反應(yīng) 24 h。隨后將反應(yīng)液溫度降至4 ℃以下,并在4 ℃條件下10000 r/min離心15 min,移除少量冷卻過(guò)程中出現(xiàn)的不溶性物質(zhì)。在4 ℃去離子水中,每隔6 h更換一次去離子水,透析72 h去除多余的AAPH,最后冷凍干燥得到核桃氧化蛋白,并置于4 ℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 核桃氧化蛋白羰基含量的測(cè)定 參照Huang等[10]的方法略改。將核桃氧化蛋白用去離子水配制為5 mg/mL的蛋白溶液,以雙縮脲指示劑法測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的濃度(y=0.2412x+0.0135,R2=0.997)。在367 nm處用2,4-二硝基苯肼比色法進(jìn)行比色,每毫克蛋白質(zhì)羰基衍生物的摩爾數(shù)通過(guò)以22000 M-1cm-1消光系數(shù)進(jìn)行計(jì)算,公式如下:

蛋白羰基含量(nmol/mg)=45.45A367n/c

其中,n為稀釋因子;c為蛋白質(zhì)溶液的濃度,mg/mL。

1.2.4 核桃氧化蛋白游離巰基和總巰基含量的測(cè)定 根據(jù)Wu等[4]的方法略改,采用DNTB比色法。核桃蛋白樣品溶于0.1 mol/L含有1 mmol/L EDTA和1%十二烷基硫酸鈉(SDS)pH8.0的磷酸鹽緩沖液中,雙縮脲指示劑法測(cè)定上清液中蛋白濃度。取上清液在412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以14150 M-1cm-1消光系數(shù)計(jì)算巰基和總巰基含量。公式如下:

SH含量(umol/g)=70.67A412n/c

其中,n為稀釋因子(SH為2.03,總SH為10.08);c為蛋白質(zhì)溶液的濃度,mg/mL。

1.2.5 核桃氧化蛋白表面疏水性的測(cè)定 采用ANS熒光探針?lè)╗10]。核桃蛋白樣品溶解于0.01 mol/L pH8.0 磷酸鹽緩沖液中,雙縮脲指示劑法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)濃度,將蛋白濃度控制在 0.005～0.5 mg/mL之間,加入0.008 mol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸,在395 nm激發(fā)波長(zhǎng)和473 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定熒光強(qiáng)度(靈敏度設(shè)定為6)。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖,外推至蛋白質(zhì)濃度為0,曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.2.6 核桃氧化蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 參照Wu等[4]的方法,核桃蛋白分散于去離子水中,稀釋上清液蛋白濃度至50 μg/mL。在25 ℃條件下,采用MOS-450 圓二色光譜儀測(cè)定樣品的遠(yuǎn)紫外CD光譜(190～250 nm)。三次掃描取平均值,CD譜圖用摩爾橢圓率[θ]((°)cm2dmol-1)表示。

1.2.7 核桃氧化蛋白內(nèi)源熒光的測(cè)定 核桃蛋白樣品溶解于0.01 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液,使溶液中蛋白質(zhì)的濃度為0.1 mg/mL。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定氧化修飾核桃蛋白的光譜,以溶解樣品的磷酸鹽緩沖液為空白。激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm,掃描波段為300～400 nm,靈敏度為2。

1.2.8 核桃氧化蛋白粒徑分布的測(cè)定 根據(jù)Huang等[10]的方法略改。將核桃蛋白樣品溶解于0.01 mol/L pH7.0 磷酸鹽緩沖液中,使蛋白濃度最終為1 mg/mL,采用納米粒度分析儀測(cè)定核桃蛋白粒徑分布。

1.2.9 核桃氧化蛋白相對(duì)分子量的測(cè)定 根據(jù)Huang等[10]的方法略改。將核桃蛋白樣品分散于去離子水中。使上清液蛋白濃度為1 mg/mL,上清液過(guò)孔徑0.45 μm的醋酸纖維素膜,收集濾液采用Water 2690型液相色譜系統(tǒng)檢測(cè),紫外檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm,流速:1 mL/min,柱溫:25 ℃。用10種化學(xué)物質(zhì)對(duì)進(jìn)行曲線校正(甲狀腺球蛋白、醛縮酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、過(guò)氧化物酶、腺苷酸激酶、肌紅蛋白、核糖核酸酶、抑肽酶、維生素B12)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃氧化蛋白羰基含量分析

蛋白質(zhì)暴露在氧化環(huán)境下,羰基形成是主要的化學(xué)特性之一。羰基化是蛋白質(zhì)不可逆轉(zhuǎn)的非酶促修飾的過(guò)程,它涉及到氧化應(yīng)激下羰基的形成[11]。蛋白質(zhì)氧化程度通常以羰基含量變化多少為指標(biāo)。氧化后核桃蛋白羰基含量變化如圖1所示,隨著氧化濃度的增加,羰基含量均明顯增加。未氧化的WPI其羰基含量最低為2.44 nmol/mg,隨著AAPH濃度增加,羰基含量顯著增加至5.35 nmol/mg,表明過(guò)氧自由基誘使核桃蛋白發(fā)生了氧化。推測(cè)是具有NH-或NH2結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)側(cè)鏈極易受到氧化,導(dǎo)致羰基含量增加[12],也可能是由于氨基酸殘基受到AAPH熱降解形成的過(guò)氧自由基的攻擊[13]或氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)骨架的解體[14],致使羰基含量增加。Ye等[15]的研究結(jié)果表明,AAPH可誘使花生蛋白質(zhì)羰基顯著增加。Wu等[16]發(fā)現(xiàn)經(jīng)丙二醛氧化的大豆蛋白,其羰基含量會(huì)顯著增加。

圖1 AAPH濃度對(duì)核桃氧化蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effect of AAPH concentration on the carbonyl contents of walnut oxidized protein注:字母不同表示不同氧化程度的 核桃蛋白樣品之間差異顯著(p<0.05)。

2.2 核桃氧化蛋白巰基和總巰基含量分析

半胱氨酸殘基和含硫化合物對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響起著重要的作用,通常用巰基和總巰基含量變化反映其二者的氧化狀態(tài)[17]。蛋白質(zhì)氧化通常伴隨著自由硫醇基的減少,其在不同的氧化環(huán)境下,可以被氧化成可逆(蛋白二硫化物或次磺酸)或不可逆(亞磺酸或磺酸)形式[18]。AAPH濃度對(duì)核桃氧化蛋白游離巰基和總巰基含量的影響如表1所示,AAPH濃度增加,導(dǎo)致核桃氧化蛋白游離巰基和總巰基含量下降,產(chǎn)生這樣的結(jié)果可能是蛋白質(zhì)氧化改變了半胱氨酸的氧化還原狀態(tài),巰基和二硫鍵交互反應(yīng)的平衡常數(shù),而使蛋白質(zhì)中巰基和二硫鍵的數(shù)量和分布被改變[19]。ROO·能夠迅速與蛋白質(zhì)游離巰基反應(yīng)形成亞磺酰自由基,隨后與分子氧接合形成硫醇自由基,硫醇自由基可進(jìn)一步誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化,致使巰基含量下降。Wu等[20]在研究AAPH氧化大豆蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)巰基和總巰基的變化在也存在類似的變化規(guī)律。由于半胱氨酸和二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有重要影響[21],氧化可以誘發(fā)WPI自由的硫?；鶊F(tuán)的減少,從而引起蛋白結(jié)構(gòu)變化。

表1 AAPH濃度對(duì)核桃氧化蛋白 游離巰基和總巰基含量的影響Table 1 Effect of AAPH concentration on free sulfhydryl/total sulfhydryl groups contents of walnut oxidized protein

2.3 核桃氧化蛋白表面疏水性分析

蛋白質(zhì)的表面疏水性在評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)和構(gòu)象變化的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,可以表達(dá)蛋白質(zhì)分子間相互作用的能力[22],是反映蛋白質(zhì)表面疏水氨基酸的一個(gè)重要指標(biāo),它與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)密切相關(guān)[23]。氨基酸的相對(duì)含量可以用表面疏水性來(lái)反映,進(jìn)而可用來(lái)衡量蛋白質(zhì)變性程度。核桃氧化蛋白后表面疏水性的變化如圖2所示,隨著AAPH濃度的增加,其表面疏水性逐漸下降(p<0.05)。這可能是由氧化改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象,內(nèi)部的脂肪族與芳香族氨基酸側(cè)鏈氧化,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi),內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露,暴露的疏水基團(tuán)相互作用,使核桃蛋白形成聚集體而造成的[24]或者是由于氧化使蛋白結(jié)構(gòu)打開(kāi)又重新組合,使疏水基團(tuán)嵌入,新的親水基團(tuán)形成(如羰基),導(dǎo)致疏水基團(tuán)下降[25]。黃友如[26]在研究亞油酸對(duì)大豆蛋白氧化時(shí)結(jié)果顯示,隨反應(yīng)時(shí)間增加,大豆蛋白氧化程度增加,表面疏水性逐漸下降。實(shí)際的表面疏水性主要是由蛋白質(zhì)中分散的或聚集的顆粒決定的[27],蛋白質(zhì)共價(jià)聚集,促進(jìn)疏水基團(tuán)掩埋而減少,由此說(shuō)明其結(jié)構(gòu)得到改變。

圖2 AAPH濃度對(duì)核桃氧化蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of AAPH concentration on surface hydrophobicity of walnut oxidized protein注:字母不同表示不同氧化程度的 核桃蛋白樣品之間差異顯著(p<0.05)。

2.4 核桃氧化蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

遠(yuǎn)紫外CD的變化,可以反映具有光學(xué)活性基團(tuán)的肽鏈骨架中的肽鍵的變化,進(jìn)而可用來(lái)表征過(guò)氧自由基氧化對(duì)核桃蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響[28]。核桃蛋白樣品的遠(yuǎn)紫外CD圖譜見(jiàn)圖3所示,天然核桃蛋白在208 nm和222 nm,具有兩個(gè)明顯的負(fù)峰,說(shuō)明在核桃蛋白質(zhì)中,α-螺旋是最主要的結(jié)構(gòu)。194 nm處正峰和218 nm處負(fù)峰,表示核桃氧化蛋白中存在β-折疊。隨著AAPH含量的增加,194 nm處正峰強(qiáng)度以及218 nm處負(fù)肩峰強(qiáng)度都呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這說(shuō)明過(guò)氧自由基氧化使得核桃蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)的含量下降。而在天然核桃蛋白中,在200 nm處為正峰。當(dāng)AAPH含量增加后,200 nm處顯示為負(fù)峰,說(shuō)明無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)有所增加。與未氧化的WPI相比,樣品顯示在氧化處理后α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)減少,無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加。由于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴于氨基酸的局部序列和分子不同部位之間的相互作用[29],上述結(jié)果表明氧化會(huì)破壞這些相互作用,從而導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

圖3 AAPH濃度對(duì)核桃氧化蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響 Fig.3 Effect of AAPH concentration on Ultraviolet CD spectrum of walnut oxidized protein

2.5 核桃氧化蛋白內(nèi)源熒光分析

色氨酸最大內(nèi)源熒光發(fā)射波譜可以指示色氨酸殘基在蛋白質(zhì)內(nèi)的相對(duì)位置,因此被用來(lái)作為蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)改變的指示器[30]。同時(shí)可以指示蛋白質(zhì)色氨酸殘基的氧化程度及其微環(huán)境的變化,進(jìn)而能夠表征蛋白質(zhì)氧化對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。核桃蛋白氧化后內(nèi)源熒光的變化如圖4所示。從譜圖可以看出,天然核桃蛋白最大熒光峰位在335 nm處。當(dāng)AAPH為25 mmol/L時(shí),核桃蛋白λmax強(qiáng)度降低到天然蛋白的55.7%,最大熒光峰位發(fā)生藍(lán)移。其熒光藍(lán)移,說(shuō)明隨著氧化程度的增加,色氨酸被轉(zhuǎn)移到更加疏水的非極性環(huán)境中[31]。Wu研究氧化大豆蛋白時(shí),結(jié)果顯示最大內(nèi)源熒光藍(lán)移,表明先前暴露的色氨酸殘基經(jīng)氧化修飾后被隱藏,導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集[16]。Chen等[32]研究氧化大豆蛋白時(shí),結(jié)果顯示隨著氧化濃度的增加,疏水基團(tuán)暴露,也導(dǎo)致蛋白聚集形成。內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降,可能是由于烷過(guò)氧自由基氧化導(dǎo)致分子聚集,使得色氨酸殘基包埋,也可能是由于烷過(guò)氧自由基氧化修飾對(duì)295 nm激發(fā)下的蛋白色氨酸殘基有熒光猝滅作用[33]。邱天福[34]在氧化大豆蛋白研究產(chǎn)生了與本研究結(jié)果相一致的結(jié)論。

圖4 AAPH濃度對(duì)核桃氧化蛋白內(nèi)源熒光的影響Fig.4 Effect of AAPH concentration on intrinsic fluorescence of walnut oxidized protein

2.6 核桃氧化蛋白粒徑分布分析

動(dòng)態(tài)光散射(DLS)用于監(jiān)測(cè)聚集物的形成,作為一種定量的靈敏而有效的方法已被得到認(rèn)可[32]。天然WPI和烷過(guò)氧自由基修飾WPI的體積-粒徑分布如5所示。如圖得出,其粒徑分布大多集中在0～1000 nm之間,峰值出現(xiàn)在300 nm左右。當(dāng)核桃蛋白濃度提高到0.2 mmol/L時(shí),其峰值范圍變寬,粒徑顆粒較為分散。隨著濃度升高至25 mmol/L時(shí),于500～1000 nm之間出現(xiàn)一個(gè)小峰,此時(shí)AAPH高濃度氧化,導(dǎo)致蛋白粒徑逐漸增大,表明過(guò)氧自由基氧化誘使核桃蛋白形成了氧化聚集體。圖中當(dāng)AAPH濃度從0.2～1 mmol/L時(shí),粒徑顆粒變小,這可能是由于小的可溶性聚集體斷裂成更小的小分子多肽,而氧化濃度進(jìn)一步增加,粒徑顆粒變大,可溶性部分通過(guò)共價(jià)交聯(lián)和非共價(jià)聚集轉(zhuǎn)變成不可溶性部分。這與表1得到結(jié)果相一致,AAPH濃度增加,游離巰基減少,說(shuō)明S-S形成,形成的S-S有助于蛋白聚集,由此可以增加蛋白粒徑。由此表明,較高的AAPH濃度,可以促進(jìn)不可溶性組分形成,導(dǎo)致蛋白分子聚集[35]。

圖5 AAPH濃度對(duì)核桃氧化蛋白粒徑分布的影響Fig.5 Effect of AAPH concentration on particle size distribution of walnut oxidized protein

2.7 核桃氧化蛋白相對(duì)分子量分布分析

通過(guò)分子排阻色譜可以得到WPI的分子量分布,分析AAPH氧化WPI聚集后分子的大小,反映蛋白質(zhì)氧化對(duì)WPI聚集形態(tài)的影響。體積排阻分析結(jié)果如圖6和表2所示。在相同測(cè)定條件下,測(cè)定的10種標(biāo)準(zhǔn)蛋白校正曲線如圖6A所示。未氧化的WPI呈現(xiàn)一個(gè)主峰,其相對(duì)分子量為0.18 kDa,峰面積為90.27%(圖6B)。此結(jié)果表明WPI相對(duì)分子量分布較為均勻,這一較低分子量的峰(0.18 kDa)可能為低分子多肽。隨著AAPH濃度增加到0.04 mmol/L,出現(xiàn)分子量為6.87 kDa(峰面積71.83%)和分子量為4.45 kDa(21.23)兩個(gè)新峰(圖6C),表明大分子量形成,蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。隨著AAPH濃度的增加,6.87 kDa的大分子量所占比例,先增加后減小。由高效液相凝膠色譜譜圖可以看出,AAPH在低濃度時(shí),誘導(dǎo)WPI形成小的聚集體,這一聚集體進(jìn)一步聚集,形成較大的顆粒聚集體。此結(jié)果與粒徑分布結(jié)果相一致,說(shuō)明高濃度氧化引起WPI可溶性聚集體含量下降,較大不可溶性聚集體形成。

表2 AAPH濃度對(duì)核桃氧化蛋白分子量分布的影響(%)Table 2 Effect of AAPH concentration on molecular weight distribution of walnut oxidized protein(%)

圖6 AAPH濃度對(duì)核桃氧化蛋白分子量分布的影響Fig.6 Effect of AAPH concentration on molecular weight distribution of walnut oxidized protein注:A. Shodex KW-804蛋白柱的標(biāo)準(zhǔn)曲線;B～G. AAPH濃度分別為0、0.04、0.2、1、5、25 mmol/L。

3 結(jié)論

蛋白自由基可以和過(guò)氧自由基反應(yīng),引起核桃蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象發(fā)生改變。具體表現(xiàn)在,AAPH氧化濃度的增加導(dǎo)致羰基含量累積,巰基和總巰基含量逐漸減少,非共價(jià)二硫鍵形成。伴隨著其α-螺旋和β-折疊有序結(jié)構(gòu)減少,無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加。粒徑增加,高分子量聚集體含量逐漸增大,表明蛋白通過(guò)疏水作用、氫鍵結(jié)合或離子鍵相互作用,致使蛋白形成更大的聚集體。蛋白質(zhì)氧化對(duì)核桃蛋白的理化特性及結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生一定的影響。過(guò)氧自由基氧化修飾對(duì)核桃分離蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著的影響。