郭嘉鳳，田雙紅，易曉芹，賀群，謝念祠，沈程文

（國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，茶學教育部重點實驗室，湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南長沙 410128）

茶樹起源于中國云貴高原，為多年生常綠葉用作物。在茶樹的鮮葉中，水分占75.0%，干物質(zhì)為25.0%左右。茶葉的化學成分是由 3.5～7.0%的無機物和93.0～96.5%有機物組成。茶葉有機化合物或無機鹽形式存在的基本元素有30余種。到目前為止，茶葉中經(jīng)分離、鑒定的已知化合物有700多種，其中包括蛋白質(zhì)、脂肪及其二級產(chǎn)物-多酚類、色素、茶氨酸、生物堿、芳香物質(zhì)、皂苷等[1]。

群體育種亦稱混合育種，與系統(tǒng)育種相并列。系統(tǒng)育種，從早期世代開始就進行株系選擇，而群體選擇，不在早代進行單株選擇，而是以雜種群體狀態(tài)自由栽培，直到后期世代才作單株選擇，育成系統(tǒng)。以茶樹單株營養(yǎng)體為材料，采用無性繁殖法繁殖的品種（品系）稱無性系品種（品系），簡稱無性系。無性系茶樹良種是優(yōu)質(zhì)茶生產(chǎn)的原料，其種質(zhì)優(yōu)良，萌發(fā)提早7～10 d，發(fā)芽整齊，內(nèi)含物豐富，制茶品質(zhì)優(yōu)異，產(chǎn)量提高20.0～30.0%，效益比群體種高一倍，無性系良種茶園是茶產(chǎn)業(yè)競爭力的基礎(chǔ)。

鮮葉是茶樹頂端新稍的總稱，包括芽、葉和梗。鮮葉又稱生葉、青葉等。采摘下來的茶葉嫩梢經(jīng)過不同的加工之后，便形成各種不同品質(zhì)特征的成品茶。鮮葉是形成茶葉品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)。茶葉品質(zhì)高低，主要取決于鮮葉質(zhì)量的高低，制茶技術(shù)是否合理。因此，要制出優(yōu)良品質(zhì)的茶葉，首先必須了解鮮葉內(nèi)含化學成分的性質(zhì)。茶葉作為目前全球消費的主流飲品，引領(lǐng)著人類的生活向著生態(tài)、健康、和諧進發(fā)。茶葉不僅作為飲品，更具有神奇的保健治療作用，國內(nèi)外人士一直在探索茶葉這一神秘的天然抗氧化劑。茶葉中含有豐富的抗氧化物質(zhì)，目前國內(nèi)外關(guān)于茶葉的保健功效研究也主要集中在茶葉的抗氧化能力方面。研究表明，茶葉中的多酚類、黃酮類化合物，甚至一些微量元素如硒、錳等都具有一定的抗氧化作用[2]。研究表明，茶葉能有效清除自由基[3]，抑制活性氧的形成，具有良好的抗氧化能力[4]。這與其含有較高的抗氧化物有關(guān)，如茶黃素、沒食子酸和黃酮等，尤其富含兒茶素，其含量占茶葉干重的 30.0%[5]。近年來，國內(nèi)外對茶葉及其提取物的藥理藥效作用進行了大量的研究，研究表明茶葉及其提取物具有抗突變、防癌抗癌、清除自由基、抗氧化、免疫調(diào)劑、抗過敏、延緩衰老、降血糖、血脂及利尿等功能。其中，茶葉抗氧化、抗衰老作用是其最主要的功能之一[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗原料

龍井群體種和龍井43號（從龍井群體品種中采用系統(tǒng)選種法育成），采自浙江省余杭市浙江大學茶學試驗基地，樹齡6年；云南群體種和云抗10號（從云南群體品種中采用系統(tǒng)選種法育成），采自云南省普洱市云南茶科所品種資源圃，樹齡6年。安化群體種和櫧葉齊（從安化群體品種中采用系統(tǒng)選種法育成），采自湖南省安化縣湖南省云上茶業(yè)有限公司茶園基地，樹齡6年。實驗采用6個不同茶樹類型一芽二葉鮮葉固定樣。

1.1.2 試劑

甲醇、碳酸鈉、福林酚試劑、乙酸、乙二胺四乙酸、抗壞血酸、鐵氰化鉀、水楊酸、無水對氨基苯磺酸、30%過氧化氫、氯化高鐵、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、濃鹽酸，國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），東京化工業(yè)株式會社；N-1-萘乙二胺鹽酸鹽，天津市化學試劑研究所；三氯乙酸，上海三愛思試劑有限公司；兒茶素標準品，上海哈靈生物科技有限公司，純度：HPLC檢測≥60%。以上試劑皆為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

分析天平、混勻器、高效液相色譜儀、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、液相色譜柱、101-1AB型電熱鼓風干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HH·W21·600型電熱恒溫水箱，上海啟前電子科技有限公司；FA2104S型電子天平，上海恒平科學儀器有限公司；KQ3200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；WFZUV-2102PCS型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；DD5大容量離心機，西安禾普生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶湯的制備

稱取0.075 g冷凍干燥樣品用10 mL的100 ℃蒸餾水浸提，100 ℃水浴鍋保溫10 min，抽濾去除茶渣，待茶湯冷卻后，定溶至25 mL。用10倍稀釋法和2倍稀釋法將茶湯稀釋成不同濃度（另設(shè)純度大于60%兒茶素陽性對照）。

1.2.2 抗氧化成分的測定

1.2.2.1 茶多酚含量的測定

多酚類物質(zhì)測定采用Folin-Ciocalteu法[6]，其含量用mg沒食子酸/mL茶湯表示。

1.2.2.2 兒茶素總量和咖啡堿的測定

兒茶素及咖啡堿含量的測定采用高效液相色譜（HPLC）法，以mg/mL表示。

1.2.2.3 沒食子酸的測定

沒食子酸含量采用高效液相色譜（HPLC）法測定，以mg/mL表示。

1.2.2.4 總黃酮的測定

總黃酮三氯化鋁法測定，參考何書美等[10]的方法，以mg/mL表示。

1.2.3 體外抗氧化性能的測定

1.2.3.1 鮮葉固定樣清除DPPH自由基研究[7]

DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3個苯環(huán)，1個氮原子上有1個孤對電子，呈紫色，在517 nm有強吸收。有自由基清除劑存在時，DPPH的單電子被配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，而且這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)是成化學劑量關(guān)系的，因此可用于檢測自由基的清除情況，從而評價鮮葉固定樣的抗氧化能力。

將濃度為3、1.5、0.3、0.03、0.003 mg/mL的茶湯，分別取2 mL上述溶液于試管中，加入2 mL用無水乙醇配制的DPPH溶液。用力振搖混勻后置暗室中靜置 30 min，于 517 nm 波長處測定吸光度。以純度＞60%的兒茶素作為陽性對照。蒸餾水做空白對照。按下式計算DPPH清除率。

注：式中：Ax為加入樣品溶液和DPPH后的吸光度；Ax0為樣品溶液本底的吸光度；A0為DPPH-和蒸餾水的吸光度。

1.2.3.2 鮮葉固定樣清除羥自由基研究[8]

通過Fenton反應產(chǎn)生-OH，水楊酸捕獲-OH產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm有特征吸收，通過測定水楊酸捕獲-OH所得到的產(chǎn)物，確定-OH的清除率。從而評價鮮葉固定樣的抗氧化能力。

將濃度為3、1.5、0.15、0.015、0.0075 mg/mL的茶湯，分別取1 mL上述溶液于試管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL，最后加入8 mmol/L H2O2溶液1 mL以啟動反應，37 ℃水浴加熱30 min后終止反應，于510 nm測定吸光度。以純度大于60%的兒茶素為陽性對照。蒸餾水做空白對照。按下式計算-OH清除率。

注：式中：A”0為空白對照液的吸光度；A"x為加入樣品溶液后的吸光度；A"X0為不加顯色劑 H2O2樣品溶液本底的吸光度。

1.2.3.3 鮮葉固定樣清除亞硝基研究[9]

NO2-在酸性條件下與對氨基苯磺酸重氮反應后，再與N-1苯基乙二胺鹽酸鹽偶合生成紫紅色絡(luò)合物，在540 nm處有最大吸收，可用比色法測定NO2-的量。

分別吸取5 mg/L的NaNO2標準液2.0 mL于試管中，分別加入濃度為6、3、1.5、0.75、0.075 mg/mL的茶湯1 mL于試管中，常溫下反應30 min，然后分別加入0.4%對氨基苯磺酸溶液 1.0 mL，搖勻靜置5 min，再分別加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液0.5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻靜置15 min后于538 nm波長處測定吸光度。以純度大于60%的兒茶素為陽性對照。按下式計算亞硝基清除率。

注：式中：A'0為不加提取液時NaNO2吸光度；A'x為加入提取液后NaNO2的吸光度；A'X0為不加NaNO2時樣品的吸光度。

1.2.3.4 鮮葉固定樣的總還原能力研究[11]

原理為：K3Fe(CN)6+樣品→K4Fe(CN)6+K4Fe(CN)6+Fe3+→Fe4[Fe(CN)6]，讓鮮葉固定樣在波長700 nm條件下測定吸光度A，A越大，則樣品的還原力越大。

將濃度為3、1.5、0.15、0.015、0.0015 mg/mL的茶湯，分別取1 mL上述溶液于試管中，加入0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH=6.6）和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL并混合均勻，混合液50 ℃保溫20 min后，加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應，3500 r/min離心分離10 min。吸上層清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%FeCl3，混合均勻，30 min后于700 nm波長處測定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化成分

6個品種茶多酚、兒茶素、沒食子酸、咖啡堿及總黃酮含量如下表1所示，安化群體種（23.66±0.02 %）的茶多酚含量在6個品種中最高，安化群體種、云南群體種及龍井群體種的茶多酚含量均分別高于其選育出的無性系良種，6個品種的茶多酚含量差異顯著（p＜0.05）。兒茶素含量6個品種差異顯著（p＜0.05），安化群體種（12.84±0.11 mg/mL）含量最高。6個品種中沒食子酸含量差異顯著（p＜0.05），云抗 10號（0.65±0.23 mg/mL）沒食子酸含量最高，櫧葉齊（0.18±0.03 mg/mL）最低。6個品種中咖啡堿含量差異不顯著，其中云南群體種（3.74±0.14 mg/mL）含量最高。6個品種中云南群體種（14.55±0.15 mg/g）總黃酮含量最高，云南群體種及云抗10號（10.08±0.33 mg/g）顯著高于其他4個品種（p＜0.05）。

表1 6個品種中主要抗氧化成分含量Table 1 The main antioxidant contents in 6 tea samples

2.2 對DPPH的清除作用

圖1 對DPPH的清除效果Fig.1 The removal effect of DPPH

由圖1可以看出隨著茶湯質(zhì)量濃度的增加，清除活性逐漸增大，表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系。茶湯對DPPH自由基良好的清除效果是因為其所具有的酚羥基可有效捕捉并將氫供給自由基，自身轉(zhuǎn)變?yōu)榉友踝杂苫Ｓ捎诜优c連接苯環(huán)的p-π共軛作用對酚氧自由基具有特殊的穩(wěn)定性，降低了自動氧化鏈反應的傳遞，從而對進一步氧化實現(xiàn)抑制[12]。

IC50值越小清除效果越好。龍井群體種在6個品種中的清除效果最佳，其中龍井群體種、安化群體種、云南群體種對DPPH的清除效果優(yōu)于純度大于60%的兒茶素，而櫧葉齊、云抗10號、龍井43號對DPPH的清除效果均低于純度大于60%的兒茶素。6個品種對DPPH的清除效果如下：龍井群體種＞安化群體種＞云南群體種＞櫧葉齊＞云抗10號＞龍井43號。

2.3 對羥基自由基的清除作用

圖2 清除羥基自由基的效果Fig.2 The effect of scavenging hydroxyl radicals

茶湯與純度大于60%的兒茶素對-OH的清除率均隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，但前者對-OH的清除率略低于純度大于60%的兒茶素。兒茶素結(jié)構(gòu)中的酚羥基可與產(chǎn)生-OH等自由基所必需的金屬離子（如Fe2+、Cu2+等）絡(luò)合，使自由基的產(chǎn)生受到抑制，進而影響脂質(zhì)過氧化的啟動，最終抑制活性氧的產(chǎn)生[8,13]。對于-OH而言，兒茶素上的氫原子可以與其結(jié)合成水，達到清除-OH的目的，而兒茶素的碳原子則因此成為碳自由基，并進一步氧化形成過氧自由基，最后分解成對機體無害的產(chǎn)物[14～18]。由圖 2可以看出對清除-OH的 IC50茶湯濃度最低的是純度大于 60%的兒茶素，其次是安化群體種，安化群體種在6個品種中的清除效果最佳，6個品種對-OH的IC50如下：安化群體種＞櫧葉齊＞龍井43號＞龍井群體種＞云抗10號＞云南群體種。

2.4 對亞硝基的清除作用

圖3 對亞硝基的清除效果Fig.3 The removal effect of nitroso

由圖3可以看出，在質(zhì)量濃度0.075～0.75 mg/mL范圍內(nèi)，茶湯對亞硝基的清除活性在迅速增加，之后隨著質(zhì)量濃度的增加清除活性緩慢增加，趨于90%。6個品種對亞硝基的清除效果均低于純度大于60%的兒茶素，安化群體種清除亞硝基的能力略高于其他 5個品種。6個品種對亞硝基的IC50清除效果如下：安化群體種＞櫧葉齊＞龍井 43號＞龍井群體種＞云抗 10號＞云南群體種。

2.5 總還原能力

圖4 總還原能力Fig.4 Total reduction capacity

由圖4可以看出在0.0015～3 mg/mL范圍內(nèi)，6個品種鮮葉固定樣茶湯和純度大于60%的兒茶素都具有較強的還原能力，隨著質(zhì)量濃度的增加，還原能力越強，6個品種的還原能力與純度大于60%的兒茶素基本相近。表現(xiàn)出無性系良種優(yōu)于其群體種。6個品種中還原能力高低大致為：櫧葉齊＞安化群體種＞龍井43號＞龍井群體種＞云抗10號＞云南群體種。

3 結(jié)論

3.1 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同類型茶樹品種的生物活性成分、種類及抗氧化活性能力明顯不同。安化群體種的茶多酚（23.66±0.02%）和兒茶素（12.84±0.11 mg/mL）明顯高于其他品種；采用DPPH自由基清除能力，羥自由基清除能力、亞硝基自由基清除能力三種方法評價龍井群體種、龍井43號、云南群體種、云抗10號、安化群體種和櫧葉齊6個品種的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)其均具有較好的抗氧化活性，其中安化群體種的抗氧化活性更強。

3.2 茶樹是多年生木本植物，基因型高度復雜。雜種優(yōu)勢是生物界一種普遍現(xiàn)象，指遺傳組成不同的2個親本雜交產(chǎn)生的F1代在生長勢、生活力、繁殖力、產(chǎn)量、抗性和適應性等方面超過其雙親的現(xiàn)象。系統(tǒng)育種從早期世代開始株系選擇，而群體選擇是以雜種群體狀態(tài)自由栽培，直到后期世代才作單株選擇。無性系茶樹良種以茶樹單株營養(yǎng)體為材料，采用無性繁殖法繁殖。而且生物體的生長發(fā)育是一個動態(tài)過程，每一個基因的表達調(diào)控受環(huán)境等因素影響深遠，再加上研究材料的局限性，因此還不能對本次試驗結(jié)果中個別群體種在抗氧化性能及理化成分高于其無性系良種，做出明確解釋[19]。汪新兵等[20]研究的群體種和無性系良種加工開化龍頂茶品質(zhì)對比實驗中，采用高海拔鳩坑群體種加工的開化龍頂紅茶品質(zhì)最好，低海拔的鳩坑群體品種次之，翠峰和福鼎品種明顯差于鳩坑群體品種。且茶樹地方群體種對所處環(huán)境有較強的適應性，陳美麗等[21]人采用柳州地方資源圃群體種、福鼎大白茶、桂綠1號3個品種的鮮葉原料加工成柳州地方工夫紅茶，并進行了地方群體種和無性系良種所制紅茶的品質(zhì)比較分析。綜合分析表明，柳州地方群體種所制工夫紅茶無論在感官品質(zhì)上，還是生化成分含量上，均表現(xiàn)出與福鼎大白茶所制紅茶品質(zhì)相當，與桂綠1號所制紅茶相比品質(zhì)更優(yōu)的特點。

3.3 茶葉中的多酚物質(zhì)能有效地清除體內(nèi)自由基，從而防止因自由基過剩而產(chǎn)生的生物大分子損傷，具有較強的抗氧化能力，是天然抗氧化劑的潛在資源。兒茶素對超氧陰離子具有消除效果，可降低血清中脂質(zhì)過氧化物的濃度，從而在降血脂方面產(chǎn)生良好的效果。而且兒茶素對DPPH自由基良好抑制關(guān)系，可以在抗癌方面具有良好表現(xiàn)。而且通過研究發(fā)現(xiàn)兒茶素能夠使運動時的動物更有效的利用脂肪酸作為能量的來源，減少糖酵解和乳酸的堆積，這對增強耐力及抗疲勞十分有利。東方等[22]比較不同程度茶葉的體外與體內(nèi)抗氧化功能，結(jié)果表明：綠茶中的多酚含量高于紅茶與普洱茶，而黃酮含量則低于紅茶與普洱茶；紅茶與普洱茶具有相當量的沒食子酸，且含量均高于綠茶。體外清除DPPH自由基能力的大小依次為綠茶＞紅茶＞普洱茶。三類茶均能顯著提高小鼠血清與肝組織中的GsH-Px活性(p＜0.05)；綠茶與紅茶均能顯著提高小鼠肝組織中的SOD活性(p＜0.01)，普洱茶能顯著降低血清與肝組織中的MDA含量(p＜0.05)。不同的發(fā)酵程度對茶葉中多酚組成、體外清除自由基作用及對小鼠的抗氧化功能具有顯著影響。在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些未知的高分子量多酚類物質(zhì)（如兒茶素衍生物或聚合物）還有待于進一步的研究。

3.4 上述實驗采用體外抗氧化模型，以純度大于60%的兒茶素為陽性對照研究6個不同類型茶葉的抗氧化性能。結(jié)果表明，6個品種均具有較高的還原能力，并且對DPPH、亞硝基以及-OH都有一定的清除能力。其中當茶湯濃度大于 0.25 mg/mL時，櫧葉齊清除DPPH的效果優(yōu)于其他品種；達到特定濃度時無性系良種的清除效果均高于其群體種。隨著茶湯質(zhì)量濃度的增加，其體外抗氧化性也在不斷的增強，表現(xiàn)出了良好的量效關(guān)系。6個品種的總還原能力與純度大于60%的兒茶素基本相近，櫧葉齊的總還原能力略高于其他五個品種。王昱筱等[23]以日常消費頻率較高和加工工藝有較大差異的3種茶葉-綠茶、紅茶和普洱熟茶為研究對象，經(jīng)對3種茶葉在一般沖飲濃度下主要抗氧化成分多酚和黃酮類溶出量及相應體外抗氧化活性進行分析，其中，綠茶有較強的DPPH自由基清除作用，普洱熟茶有較強的 O2-清除能力，紅茶對羥自由基的清除最強。周金偉[24]等，選用4類發(fā)酵類型共16種茶葉，以酒石酸亞鐵法測定其茶多酚含量，高效液相色譜(HPLC)法測定兒茶素、茶黃素和沒食子酸含量，三氯化鋁法測定總黃酮含量，比較不同發(fā)酵類型茶葉的主要抗氧化成分含量的差異，采用ORAC法和DPPH-清除自由基能力法分別測定其體外抗氧化能力。試驗結(jié)果表明，綠茶茶多酚含量（5.22±0.71 mg/mL）及兒茶素含量（3.52±1.03 mg/mL）顯著高于烏龍茶、紅茶和黑茶。隨著發(fā)酵程度的加深，茶多酚及兒茶素含量明顯降低。發(fā)酵過程中明顯提高了紅茶和黑茶中茶黃素和沒食子酸的含量。由 ORAC法和DPPH法測得茶葉抗氧化能力大小分別為綠茶＞烏龍茶＞黑茶＞紅茶，綠茶＞烏龍茶＞紅茶＞黑茶。結(jié)合不同的加工工藝，選用更有優(yōu)勢的原料，提高茶葉品質(zhì)。目前對茶鮮葉抗氧化性能的研究比較少，以及鮮葉經(jīng)加工成成品茶后，抗氧化性能的變化還待進一步研究。