舒靜，姜源，莊翔，陳俊霞

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)部，四川 瀘州 646000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，重慶 400016）

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，目前膀胱癌的治療尚無有效靶點(diǎn)，膀胱癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)與分子機(jī)制有待闡明[1]。核糖核酸酶抑制因子（ribonuclease inhibitor, RI）是胞漿內(nèi)1個(gè)由460個(gè)氨基酸組成的酸性蛋白[2]。筆者前期運(yùn)用GST pull down與Co-IP等證明RI與整合素連接激酶（intergrin-linked kinase, ILK）在體內(nèi)外的直接結(jié)合[3]。ILK是1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員，它可以靶向多條信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT）[4]。本研究通過探討RI與ILK相互作用對(duì)膀胱癌EMT與轉(zhuǎn)移的作用，為RI作為膀胱癌診斷與治療新的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人膀胱癌EJ細(xì)胞系（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），無特定病原體（SPF）級(jí)BALB/c裸鼠（本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），胎牛血清、RPMI 1640（Gibco公司 ），LipofectamineTM2000（Invitrogen公司），過表達(dá)載體 pCMV-3×flag-ILK 與 pCMV-3×flag、 慢病毒LV5-RI homo與LV5-NC（本實(shí)驗(yàn)室保存），兔抗人RI多克隆抗體（本實(shí)驗(yàn)室保存），兔抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2, MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9, MMP-9）、N鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、扭轉(zhuǎn)蛋白（Twist）、核轉(zhuǎn)錄因子（Snail）、重組人S100鈣離子結(jié)合蛋白A4（S100A4）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad2（Smad2）與βactin、鼠抗人ILK（Bioworld公司），熒光二抗（中杉金橋公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與慢病毒感染 含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養(yǎng)EJ細(xì)胞。按照說明書，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染pCMV-3×flag-ILK或pCMV-3×flag至EJ細(xì)胞，48 h后，以0.4 g/L的G418篩選14 d，細(xì)胞收獲后分別命名為EJ-ILK或EJ-FLAG。另以感染復(fù)數(shù)（MOI）=20的慢病毒LV5-RI homo或LV5-NC感染EJ細(xì)胞，48 h后，以0.2 g/L的嘌呤霉素篩選細(xì)胞收獲后分別命名為EJ-RI或EJ-LV5。

1.2.2 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞 細(xì)胞爬片后，或冷凍組織切片后，80%冷丙酮固定10 min，37℃下3% BSA封閉30 min，隨后4℃下1∶100稀釋的一抗孵育過夜，37℃下熒光二抗孵育2 h，除ILK使用488標(biāo)記的羊抗鼠二抗，其余均用Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗。于Leica激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行圖片獲取。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系于倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)。

1.2.4 Western blot分析蛋白表達(dá) 總細(xì)胞蛋白裂解后以30 μg每孔上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉2 h后，4 ℃下1∶500稀釋的一抗孵育過夜，再以1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗37℃下孵育2 h，ECL發(fā)光顯色，并用Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.5 裸鼠移植瘤模型復(fù)制 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞制備懸濁液，以2×106個(gè)/只接種于4周齡雄性BALB/c裸鼠背上，每組10只，30 d后處死裸鼠，獲取移植瘤及肺組織，移植瘤組織液氮冷凍后，切片，免疫熒光標(biāo)記，并于激光共聚焦顯微鏡下觀察，肺組織固定，包埋，切片，HE染色后進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RI與ILK在EJ穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中的表達(dá)

構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)RI的EJ細(xì)胞（EJ-RI）、穩(wěn)定過表達(dá)ILK的EJ細(xì)胞（EJ-ILK）、穩(wěn)定感染空載LV5的EJ細(xì)胞（EJ-LV5）、與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載FLAG的EJ細(xì)胞（EJ-FLAG）。EJ-RI細(xì)胞RI蛋白熒光強(qiáng)于各對(duì)照組，而EJ-ILK細(xì)胞ILK蛋白熒光強(qiáng)于各對(duì)照組（見圖1）。

2.2 RI與ILK共定位

運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，Alexa 594標(biāo)記RI蛋白（紅色），Alexa 488標(biāo)記ILK蛋白（綠色），Dapi染核（藍(lán)色），激光共聚焦掃描觀察EJ細(xì)胞中RI與ILK的表達(dá)，RI與ILK胞質(zhì)胞核均有表達(dá)，兩者融合之后可呈黃色，存在共定位的現(xiàn)象，兩者存在相互作用。見圖2。

2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系細(xì)胞形態(tài)

倒置相差顯微鏡下觀察各穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞形態(tài)，EJ-RI細(xì)胞、EJ-LV5細(xì)胞、EJ-FLAG細(xì)胞與EJ細(xì)胞均呈現(xiàn)上皮型細(xì)胞形態(tài)，而EJ-ILK細(xì)胞呈明顯梭形、紡錘形，具有間質(zhì)型細(xì)胞特點(diǎn)。見圖3。

2.4 EMT標(biāo)志物在各穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，EJ-RI組與EJ組比較，E-adherin表達(dá)水平升高（P＜0.05），而EJ-ILK組與EJ組比較，間質(zhì)標(biāo)志物MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、Twist、Snail與S100A4表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖4和附表。

2.5 裸鼠移植瘤中RI、ILK與EMT標(biāo)志物表達(dá)

圖1 RI與ILK在EJ細(xì)胞中表達(dá) （免疫熒光）

圖2 RI與ILK在EJ細(xì)胞中的共定位 （免疫熒光）

圖4 EMT標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果 （Western blot）

復(fù)制裸鼠移植瘤模型，移植瘤切片免疫熒光檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。EJ-RI組高度表達(dá)RI與上皮標(biāo)志物E-cadherin，EJ-ILK組高度表達(dá)ILK與間質(zhì)標(biāo)志物MMP-2、MMP-9和Vimentin。見圖5。

2.6 裸鼠自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移

HE染色裸鼠肺切片，EJ-RI組與對(duì)照相比觀察到自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移減少，EJ-ILK組與對(duì)照比較肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)增多。見圖6。

圖5 移植瘤RI、ILK與EMT標(biāo)志物的表達(dá) （免疫熒光）

附表 各組蛋白EMT標(biāo)志物比較

續(xù)附表

圖6 裸鼠肺病理切片圖（HE）

3 討論

RI具有抑制核糖核酸酶A（RNaseA）的活性，可以調(diào)節(jié)mRNA、rRNA等的含量[5]。既往研究表明，RI能與具有低RNaseA活性的血管生成素（angiogenin，ANG）發(fā)生直接結(jié)合，通過相互作用抑制ANG的活性，負(fù)性調(diào)節(jié)ANG介導(dǎo)的rRNA的轉(zhuǎn)錄和核糖體的生成，并抑制腫瘤血管生成[6-8]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)RI二級(jí)結(jié)構(gòu)中具有LRR模體，LRR模體包含2段平行排列的α-螺旋，其中存在每隔7個(gè)規(guī)律性排列的亮氨酸殘基，LRR模體為RI與其他蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用提供了有效的平臺(tái)[2]。

ILK是1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員，其位于細(xì)胞黏著斑上，可以靶向催化蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）并活化下游的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶 蛋 白（mammalian target of rapamycin，mTOR）[9-10]。ILK作為協(xié)調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)和生長(zhǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)多功能效應(yīng)器，在調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、黏附、遷移、侵襲、血管生成及EMT等基本過程中起核心的作用[11]。EMT是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中的重要啟動(dòng)步驟，EMT過程中上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)，減弱細(xì)胞間黏附，破壞細(xì)胞極性，獲得侵襲、遷移與浸潤(rùn)能力的細(xì)胞，有利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其他組織和器官，并在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移灶[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ILK能通過直接或間接作用促進(jìn)EMT的發(fā)生；ILK的表達(dá)與EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、Snail及Β-Catenin等的表達(dá)密切相關(guān)[4]。ILK在多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中高表達(dá)，其有望成為腫瘤治療中1個(gè)重要的干預(yù)靶點(diǎn)。

人類RI與ILK基因具有高度同源性，兩者均定位于11號(hào)染色體短臂1區(qū)5帶。前期研究發(fā)現(xiàn)RI與ILK蛋白在體內(nèi)體外均能直接結(jié)合[3]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，RI與ILK蛋白在膀胱癌EJ細(xì)胞中存在共定位現(xiàn)象，也提示兩者存在直接結(jié)合與相互作用。本研究運(yùn)用免疫熒光分析構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中RI與ILK的表達(dá)，上調(diào)RI抑制ILK的表達(dá)，而上調(diào)ILK顯示出相反的結(jié)果。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ILK后膀胱癌細(xì)胞呈間質(zhì)型形態(tài)，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均顯示上調(diào)ILK后膀胱癌的上皮標(biāo)志物的表達(dá)降低，而間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)增高，且過表達(dá)ILK的移植瘤呈現(xiàn)更強(qiáng)的自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移能力。而過表達(dá)RI抑制體內(nèi)外EMT的發(fā)生，降低膀胱癌肺轉(zhuǎn)移的能力。本結(jié)果均提示RI與ILK的相互作用表現(xiàn)為互相拮抗。本研究通過探討RI與ILK相互作用發(fā)現(xiàn)其對(duì)膀胱癌EMT與轉(zhuǎn)移的作用，并揭示潛在的分子機(jī)制，為RI作為膀胱癌診斷與治療新的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。