郭小慶

（上海熠品質(zhì)量技術(shù)服務有限公司，上海 201101）

臨床使用后，可重復使用醫(yī)療器械必須經(jīng)過嚴格且有效的再處理，以確保隨后的安全使用。有三個類型的風險伴隨醫(yī)療器械的再使用：1）疾病通過器械從一個病人向另一個病人傳播；2）器械再處理后其性能不能滿足臨床使用要求；3）對血源性病原體或其他潛在性傳染材料的職業(yè)暴露風險。再處理過程通常包括清洗、消毒或者滅菌，以及再處理后器械性能測試。根據(jù)醫(yī)療器械的預期用途、與人體接觸的部位以及可能受到的臨床污染類型、污染后使用所致感染的危險性大小及在患者使用之間的消毒或滅菌要求，國際上使用斯波爾丁分類規(guī)則，將可重復使用醫(yī)療器械分為高度危險性器械、中度危險性器械和低度危險性器械。

高度危險性器械：進入人體器官、無菌組織、脈管系統(tǒng)，或接觸破損粘膜、破損皮膚的器械或有無菌體液從中流過的器械。每次使用后必須經(jīng)全面清洗并滅菌處理。如腹腔鏡，手術(shù)器械、血管內(nèi)窺鏡等

中度危險性器械：與完整粘膜接觸，既不進入血液、人體器官、無菌組織也不接觸破損粘膜、破損皮膚的器械。雖然完整粘膜能夠耐受小數(shù)量的孢子，中度危險器械每次使用后要經(jīng)過全面清洗和滅菌處理或高水平消毒處理。如腸胃鏡、支氣管鏡、支氣管鏡等。

低度危險性器械： 不與粘膜接觸，而與完整皮膚接觸的器械。這類器械應當進行全面清洗、并經(jīng)過中等水平或低水平消毒處理，或是只進行全面清洗處理。如聽診器、心電電極等。

清洗是第一個也是關(guān)鍵的再處理步驟。臨床使用后器械外部或內(nèi)部附著的臨床污染物（如：微生物、有機物質(zhì)、無機物質(zhì)等）去除不徹底，會對隨后的消毒或滅菌效果產(chǎn)生不利影響，甚至導致對傳染性病原體消毒或滅菌不徹底，造成交叉感染等醫(yī)療事故。清洗方法通常包含手洗（擦拭、沖洗、刷洗等）和機洗。作為微創(chuàng)手術(shù)中常用的腹腔鏡，由于其特殊的結(jié)構(gòu)，臨床上通常通過手洗的方式進行全面清洗。本文通過模擬使用試驗，依照制造商說明書的清洗方法，驗證光學硬鏡和電子鏡的手動清洗方法的有效性，適合隨后的滅菌過程。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

1.1.1 結(jié)構(gòu)和組成

1.1.2 臨床應用污染和清洗的特殊結(jié)構(gòu)

圖1 電子腹腔鏡結(jié)構(gòu)示意圖

保護窗片和插入部分前端、插入部分前端和插入部分后端、插入部分后端和手柄、手柄結(jié)構(gòu)件之間、按鍵與手柄、手柄與傳輸線纜之間。

1.1.3 預期用途和臨床應用污物

電子腹腔鏡與其攝像系統(tǒng)共同組成電子腹腔鏡系統(tǒng)。電子腹腔鏡系統(tǒng)主要適用于腹部外科手術(shù)的輔助治療，為手術(shù)過程提供手術(shù)部位實時的清晰圖像，接觸人體內(nèi)無菌組織的醫(yī)療器械。

臨床應用污染主要有血液、組織碎屑、細菌殘留。

器械直接污染部位有：保護窗片、鏡管；間接污染部位有手柄。

1.2 試驗用主要試劑和儀器

1.2.1 主要儀器

生化培養(yǎng)箱（上海申騁儀器科技有限公司），高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司），可見分光光度計（上海奇立科學儀器有限公司），超凈工作臺（蘇州沈氏凈化設備有限公司），生物安全柜（阿爾泰實驗室設備有限公司）。

1.2.2 主要試劑

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（Lot：20151201001，杭州百思生物技術(shù)有限公司），氯化鈉（NaCl）（Lot：10019318，國藥集團化學試劑有限公司），氰化高鐵血紅蛋白標準液（Lot：20170826，天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所），總蛋白定量檢測試劑盒（BCA法）（Lot：20170615，南京建成生物工程研究所），胎牛血清（Lot：20161214，杭州四季青），脫纖維綿羊血（無菌）（Lot：20170707，Solarbio），RPMI培養(yǎng)基（Lot：AB10113944，Hyclone），D-無水葡萄糖（Lot：C10093638，麥克林），快速高效多酶清洗液（Lot：1612ST2，3M公司）。

1.3 試驗過程

1.3.1 人工污物（ATS）、目標微生物和清洗劑

人工污染物（ATS）

電子腹腔鏡所受的臨床使用污染類似，為模擬其所受的污染，實驗室配制含有牛血清、無菌羊全血、RPMI 1640培養(yǎng)基、碳水化合物（葡萄糖）、無菌蒸餾水和黃原膠。RPMI 1640培養(yǎng)基作為基礎介質(zhì)，模擬人體生理體液成分；無菌養(yǎng)全血用于模擬血液污染成分；牛血清用于模擬有機蛋白成分；葡萄糖用于模擬碳水化合物成分；無菌蒸餾水用于稀釋人工污物；黃原膠用于調(diào)整人工污物的粘稠度。

目標微生物

為模擬臨床污染中的微生物，采用萎縮芽孢桿菌懸液（ATCC 9372）作為目標微生物，菌落濃度108 CFU/mL。

清洗劑

使用中性低泡多酶清洗劑，含有脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶。（3 M安必潔）。

1.3.2 試驗方法確認

試驗方法通過設置陰性組和陽性組做對照，先要進行方法確認。

測試器械及對照器械（試劑）：

組別 制備方法測試器械 接種已知數(shù)量的接種液、進行清洗、進行萃取的器械陰性對照器械 不接種接種液、進行清洗、進行萃取的器械陽性對照器械 接種已知數(shù)量的接種液、不進行清洗、直接進行萃取的器械陰性對照試劑 空白對照，即不含器械的萃取液陽性對照試劑 將已知數(shù)量的接種液直接接種添加到空白萃取液中所得到的溶液

注1：使用相同的方法和條件對測試器械和陽性對照器械進行接種。

注2：陰性對照器械的污物殘留應等于或稍大于陰性對照試劑。

注3：陽性對照器械的污物殘留應等于或稍小于已知的接種液量。

注4：試驗使用3個重復測試器械、2個重復陽性對照器械。

分別對陽性對照器械萃取液、陰性對照器械萃取液、陽性對照試劑和陰性對照試劑和進行檢測，來確認蛋白質(zhì)、血紅蛋白、碳水化合物、目標微生物的含量。

預處理

在試驗開始前，所有的樣品按照說明書的方法，進行全面清洗處理。

器械接種

取適量的人工污物和目標微生物懸液，進行混合配置接種液。接種液含有至少108 CFU/mL目標微生物。

將接種液預熱至37度后，取完整的試驗樣品，將樣品倒置在無菌器皿中，取適量接種液用微量滴定管從保護窗端滴注腹腔鏡，直至接種液接觸到手柄。這樣確保在臨床使用時腹腔鏡可能被污染的部位都被接種。

接種結(jié)束后，腹腔鏡在室溫下干燥30分鐘，模擬腹腔鏡臨床使用后到清洗處理的等待時間。

注1：測試器械和陽性對照器械采用相同的接種方法。

注2：陽性對照器械接種結(jié)束，干燥30分鐘后，直接浸提后進行檢測。

清洗

試驗采取手工清洗的方式。清洗使用合適的清洗劑、沖洗水和工具。為模擬醫(yī)療機構(gòu)人員真實清洗過程以及考慮在清洗操作時可能發(fā)生的使用錯誤（清洗人員依照制造商提供的說明書進行清洗活動的人因工程因素），實驗人員先認真閱讀器械使用說明書并依照其使用說明書要求進行清洗操作，穿戴必要的個人防護用品如手套、口罩等。

清洗試驗過程采用在制造商規(guī)定的最不利條件下進行，如最低溫度、最短時間、最低濃度等。試驗清洗過程和制造商規(guī)定的過程如下表，測試器械和陰性對照器械采用相同的試驗清洗的條件。

表1 電子腹腔鏡清洗過程

1.3.3 浸提檢測

1.3.3.1浸提

采用棉球擦拭的方式對腹腔鏡進行全面浸提，將棉球剪碎后和洗脫液斡旋震蕩5×1 min，離心，取上清液，一部分用于理化殘留量（蛋白質(zhì)、血紅蛋白和碳水化合物）的測試，一部分用于生物負載檢測。

1.3.3.2蛋白質(zhì)

用BCA定量檢測試劑盒檢測總蛋白質(zhì)濃度。按照試劑盒說明書，首選將工作液與雙蒸水、標準樣本或工作液混合，渦旋混勻，37℃孵育30 min，再按要求加一定體積的終止液，渦旋混勻，在室溫下靜置5 min。最后用雙蒸水在波長562 nm處調(diào)零，測試并讀出各管吸光度值。

計算公式：

1.3.3.3血紅蛋白

用氰化高鐵血紅蛋白試劑測定血紅蛋白濃度。在1～50 μg/mL范圍內(nèi)稀釋6個梯度，所用稀釋試劑為空白，在540 nm波長處，用分光光度計建立標準曲線，血紅蛋白濃度為橫坐標，A540為縱坐標。

取1.5 mL的氰化高鐵血紅蛋白溶液與1.5 mL的樣品溶液混合，靜置5 min，在540 nm波長條件下讀取吸光度。根據(jù)標準曲線計算測試樣品中血紅蛋白的濃度。

1.3.3.4碳水化合物

用苯酚-硫酸法測定碳水化合物的含量。取1 mL合適濃度的葡萄糖，添加4 mL 10%苯酚溶液和4 mL蒸餾水，隨后快速添加20 mL濃H2SO4，再室溫放置10 min，在650 nm 350 nm的波長范圍內(nèi)測定混合物的最大吸光度（空白調(diào)零溶液為：1 mL蒸餾水+1 mL 10%苯酚溶液+5 mL濃硫酸）。根據(jù)葡萄糖濃度和其測試的吸光度建立標準曲線。

同樣的方法測定樣品吸光度，再根據(jù)標準曲線計算碳水化合物的濃度。

1.3.3.5生物負載

測試器械和陰性對照器械浸提液采用梯度稀釋法稀釋至10-1，10-2和10-3，陽性對照器械浸提液采用梯度稀釋法依次稀釋至10-6，10-7和10-8，各取1 mL洗脫液用平板傾注法加入制備好的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養(yǎng)基平板中。取1 mL陰性對照試劑用平板傾注法加入培養(yǎng)基平板中，陽性對照試劑采用梯度稀釋法稀釋至10-6，10-7和10-8，取1 mL用平板傾注法加入培養(yǎng)基中，胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養(yǎng)基于（30-35）℃下培養(yǎng)5天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基于（20-25）℃下培養(yǎng)7天。

1.3.4 清洗效果可接受指標

清洗效果可接受指標見表2。

表2 清洗效果可接受指標（n）

2 結(jié) 果

表3 清洗后理化指標殘留量（n）

表4 清洗后目標微生物含量（n）

3 結(jié) 論

內(nèi)窺鏡作為臨床微創(chuàng)手術(shù)中常用的器械，其重復處理的有效性直接影響臨床使用的安全性。器械清洗作為再處理的第一和關(guān)鍵步驟，清洗效果直接影響隨后的消毒或滅菌過程，制造商應向使用者提供經(jīng)確認的有效清洗方法。

本試驗通過模擬使用的方法，對兩種不同類型的內(nèi)窺鏡施加模擬臨床使用污染物，在最不利的條件下，進行清洗。清洗之后光學硬鏡和電子腹腔鏡樣品，蛋白質(zhì)、血紅蛋白、碳水化合物的含量，以及微生物的減少量均為可接受的水平，說明測試樣品的清洗方法有效。