逄　濤,　林　茜,　李　勇*,　師君麗,　鄧小鵬,孔光輝,　盧秀萍,　晉　艷

(1. 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 云南 玉溪 653100; 2. 玉溪師范學(xué)院, 云南 玉溪 653100)

馬來酰肼(1,2-二氫-3,6-噠嗪二酮,maleic hydrazide, MH)是一種人工合成的植物生長調(diào)節(jié)劑,從20世紀(jì)40年代開始應(yīng)用于農(nóng)作物[1],是國內(nèi)外煙草行業(yè)常用的抑芽劑。馬來酰肼對動物代謝的影響研究未獲得確定的結(jié)論,部分研究認(rèn)為馬來酰肼對哺乳動物毒性較低[2,3],而Swietlińska等[4]的研究則認(rèn)為其對小鼠和大鼠具有一定的致癌性,因此人類接觸馬來酰肼有一定的風(fēng)險。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)對洋蔥(球)、土豆(塊莖)、大蒜(頭)等作物中的馬來酰肼設(shè)定了最大限量值[5]。國際煙草科學(xué)研究合作中心(CORESTA)在2016年頒布的烤后煙葉農(nóng)殘指導(dǎo)殘留水平文件中規(guī)定了馬來酰肼(自由態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài))的殘留水平為80 mg/kg[6]。同樣,中國煙草總公司也于2014年公布了包括馬來酰肼在內(nèi)的煙葉農(nóng)藥的最大殘留要求[7]。因此建立一種簡單、快速的煙葉中馬來酰肼殘留分析方法對于保障煙葉安全、杜絕馬來酰肼抑芽劑的濫用具有重要意義。

馬來酰肼在煙葉中以自由態(tài)及糖苷結(jié)合態(tài)存在。其中糖苷結(jié)合態(tài)馬來酰肼包括馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷[8]和馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷[9]。近年來,人們對煙葉中農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)研究日趨重視[10-12],其中液相色譜法[13]和液相色譜-質(zhì)譜法[14,15]是目前報道較多的馬來酰肼測定方法。這些方法包含只測定自由態(tài)馬來酰肼和將馬來酰肼糖苷水解后測定其總量兩種類型。但是,只測定自由態(tài)馬來酰肼無法反映馬來酰肼的真實(shí)殘留量,而將馬來酰肼糖苷水解后測定其總量的方法目前無法對兩種糖苷物質(zhì)是否徹底水解進(jìn)行評價,且采用強(qiáng)酸強(qiáng)堿(濃鹽酸和氫氧化鈉)進(jìn)行樣品處理對實(shí)驗(yàn)操作者帶來操作風(fēng)險,也對分析儀器帶來被腐蝕的風(fēng)險。

本研究根據(jù)Newsome方法[16]合成了馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷,并以此為基礎(chǔ)在噴灑了馬來酰肼的煙葉中鑒定出馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷和馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷(見圖1)。通過前處理方法的篩選、色譜-質(zhì)譜方法的優(yōu)化,建立了煙葉中馬來酰肼及其糖苷的定量分析方法。方法前處理步驟簡單,避開了傳統(tǒng)方法中的水解反應(yīng)和固相萃取步驟,分析時間短,靈敏度高,方法的建立為快速、準(zhǔn)確監(jiān)控?zé)熑~中的馬來酰肼殘留提供了一種新的技術(shù)路線。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器與試劑

甲醇(色譜級)購于Merck公司,馬來酰肼購于Sigma公司(北京),馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷采用Newsome方法[16]合成,純度為82.04%。氧化銀、硫酸鈣、2,3,4,6-四乙酰氧基-α-D-吡喃葡萄糖溴化物、二氯甲烷、硅酸、甲醇鈉等(用于合成馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷)購于北京百靈威公司。

Waters Acquity UPLC液相色譜儀(Waters公司,美國), Absciex 5500三重四極桿質(zhì)譜(Sciex公司,加拿大); Milli-Q純水機(jī)(Millipore公司,美國); Eppendorf 5804高速離心機(jī)(Eppendorf公司,德國), Talboys數(shù)顯型多管式渦旋混合器(安譜科學(xué)儀器公司,上海); CP2245分析天平(感量0.000 1 g, Sartorious公司,德國)。Christ Alpha 1-2 LD凍干機(jī)(Martin Christ公司,德國)。

1.2　煙葉樣品的制備

用于實(shí)驗(yàn)的栽培煙草(K326)種植于云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院玉溪研和實(shí)驗(yàn)基地,移栽3個月后開始馬來酰肼噴灑實(shí)驗(yàn)。40株實(shí)驗(yàn)煙草被分成馬來酰肼噴灑組(25株)、空白對照噴灑組(10株)和空白組(5株)。其中馬來酰肼噴灑組每株噴施20 mL 10 g/L的馬來酰肼(溶于含3%(體積分?jǐn)?shù))三乙醇胺的水中,三乙醇胺用于促進(jìn)馬來酰肼溶解),空白對照噴灑組每株噴施20 mL的空白溶液(含3%(體積分?jǐn)?shù))三乙醇胺的水溶液),空白組煙株未做處理。噴灑實(shí)驗(yàn)后,分別于第0、7、14、21、28天采集處理的煙株煙葉。其中馬來酰肼噴灑組和空白對照組每次分別采收5株和2株煙葉。第0天采收煙葉時間為噴灑后約半小時,此時煙葉上噴灑的試劑已不可見?？瞻捉M(5株)煙葉在第28天集中采收,并混合成一個空白樣品。所采集的煙葉一部分直接置于-80 ℃冰箱保存,另一部分采用三段式烘烤方法[17]進(jìn)行烘烤后常溫保存。

1.3　樣品前處理

新鮮煙葉樣品制備:將新鮮的煙葉樣品放入研缽(或低溫自動研磨儀),加液氮冷凍,研磨粉碎(小于40目)。磨好的樣品迅速轉(zhuǎn)入離心管封存于-80 ℃冰箱。

烤后煙葉樣品制備:將烤后煙葉樣品放入研缽,研磨粉碎(小于40目)。磨好的樣品轉(zhuǎn)入離心管封存于4 ℃冰箱。

本實(shí)驗(yàn)所建立的樣品前處理方法:準(zhǔn)確稱取100 mg液氮下粉碎的新鮮煙末(或10 mg烤后煙葉粉末)于1.5 mL離心管,依次加入350 μL乙腈、500 μL甲基叔丁基醚、650 μL水,超聲20 min,離心(轉(zhuǎn)速10 000 r/min)5 min,取下層清液100 μL,離心濃縮(真空度0.018 Pa)30 min去掉溶劑,加入100 μL乙腈復(fù)溶,復(fù)溶液轉(zhuǎn)入帶內(nèi)襯的液相色譜進(jìn)樣小瓶,待分析。

水解后測馬來酰肼總量法的前處理方法[18]:稱取5 g煙草粉末于250 mL磨口圓底燒瓶中,加入50 mL 4 mol/L的鹽酸溶液。將圓底燒瓶放入電加熱套中,裝上球形冷凝管,加熱回流?？刂苹亓魉俣仁拐羝燎蛐卫淠艿诙蛱?連續(xù)加熱回流1 h。回流完畢放至室溫后用定性濾紙過濾試樣,濾液收集至100 mL容量瓶中,用適量4 mol/L的鹽酸溶液淋洗冷凝管和萃取過的試樣,洗液均經(jīng)過濾合并至該100 mL容量瓶中,并用鹽酸溶液定容。取2 mL甲醇和2 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液依次預(yù)淋洗C18固相萃取小柱。從100 mL容量瓶中準(zhǔn)確移取2 mL提取液加到C18固相萃取小柱上,并即刻開始收集流出組分至5 mL容量瓶中,用2 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液洗脫,合并洗脫液至該5 mL容量瓶中,并用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液定容,定容液經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾后備用。

QuEChERS法:見文獻(xiàn)[19]。

進(jìn)行樣品前處理方法對比時,3種前處理方法得到的馬來酰肼均稀釋至相同的濃度。為了便于親水作用色譜分析,3種方法處理最終溶劑均置換成乙腈。

1.4　液相色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜條件色譜柱為Waters Acquity UPLC@BEH HILIC (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。流動相:A為含0.2%(v/v)甲酸的水溶液,B為含0.2%(v/v)甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫條件:0～1.00 min, 2%A; 1.00～4.30 min, 2%A～12%A; 4.30～4.31 min, 12%A～50%A; 4.31～6.00 min, 50%A; 6.00～6.01 min, 50%A～2%A; 6.01～7.00 min, 2%A。流動相流速為0.25 mL/min;柱溫23 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件多反應(yīng)監(jiān)測,正離子模式采集。離子源參數(shù)如下:在液相色譜保留時間0～2.5 min內(nèi):噴霧電壓4 000 V;氣簾氣172 kPa;碰撞氣62 kPa;溫度700 ℃;離子源氣體1為276 kPa;離子源氣體2為621 kPa;去簇電壓60 V;入口電壓10 V;碰撞池外部電壓15 V。在液相色譜保留時間2.5～7.0 min內(nèi):噴霧電壓5 500 V;氣簾氣172 kPa;碰撞氣34 kPa;溫度250 ℃;離子源氣體1為276 kPa;離子源氣體2為414 kPa;去簇電壓60 V;入口電壓10 V;碰撞池外部電壓15 V。馬來酰肼及其糖苷的色譜-質(zhì)譜條件見表1。

1.5　標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和定量計算

基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:以甲醇為溶劑,配制10 mg/L的馬來酰肼及馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取5、10、20、40、80、150 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至1.5 mL離心管,再分別稱取10 mg空白煙末(不含馬來酰肼及其糖苷)至離心管作為樣品基質(zhì),制成5、10、20、40、80、150 mg/kg含量梯度的待測樣本。離心濃縮,除去樣品中的甲醇溶劑。將制好的樣本按照1.3節(jié)樣品前處理和1.4節(jié)色譜-質(zhì)譜條件部分所述方法進(jìn)行處理,得到每個含量梯度樣本對應(yīng)的色譜-質(zhì)譜峰面積。將得到的峰面積與其對應(yīng)的含量梯度進(jìn)行線性擬合,得到校準(zhǔn)曲線擬合方程和線性相關(guān)系數(shù)。

表 1 　馬來酰肼及其糖苷分析的色譜-質(zhì)譜分析條件

溶劑空白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:除不添加空白煙末以外,其余步驟與基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制相同。

將得到的實(shí)際樣品中的馬來酰肼及其糖苷的色譜-質(zhì)譜峰面積輸入校準(zhǔn)曲線方程,計算得到相對應(yīng)的分析物含量。由于無法獲得馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),且馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷與馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷互為位置異構(gòu)體,本方法中具有相同的MRM質(zhì)譜離子,因此采用馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的校準(zhǔn)曲線對馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷進(jìn)行定量。煙葉中馬來酰肼(游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài))的含量計算公式見式(1)。

CMH=CMH-F+CMH-G×MMH/MMH-G

(1)

其中,CMH為煙葉中馬來酰肼(自由態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài))的含量(mg/kg),CMH-F和CMH-G分別為自由態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)馬來酰肼的含量(mg/kg),MMH和MMH-G分別為馬來酰肼和馬來酰肼-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量。

1.6　基質(zhì)效應(yīng)評價

通過基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑空白標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率評價基質(zhì)效應(yīng)。具體計算公式見式(2)[20]。

ME=(1-X2/X1)×100%

(2)

其中,ME代表基質(zhì)效應(yīng),X1和X2分別代表溶劑空白標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2　結(jié)果與討論

2.1　煙葉樣品中馬來酰肼-葡萄糖苷的確定

Towers和Hutchinson[21]通過14C同位素標(biāo)記的方法證實(shí)了噴灑馬來酰肼的小麥葉片產(chǎn)生了2個馬來酰肼葡萄糖結(jié)合物。Frear等[8]以及Tagawa等[9]隨后在煙草實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這2個葡萄糖結(jié)合物為馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷和馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷。雖然這兩個糖苷物質(zhì)已經(jīng)被鑒定出來,但由于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)譜圖的缺乏,色譜-質(zhì)譜分析中這兩種糖苷的保留時間及特征離子有待確認(rèn)。

本研究采用Newsome方法[16]合成了馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷,通過在質(zhì)譜負(fù)離子模式下的分子離子m/z273 [M-H]-、二級碎片m/z111[M-162-H]-以及中性丟失m/z162(葡萄糖基),證實(shí)了馬來酰肼-葡萄糖苷的合成。Newsome[16]已經(jīng)通過核磁共振光譜等技術(shù)確認(rèn)了該方法合成的糖苷為馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷,并確認(rèn)噴灑了馬來酰肼的煙葉中產(chǎn)生的馬來酰肼的主要糖苷為馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖。本實(shí)驗(yàn)在確認(rèn)馬來酰肼-葡萄糖苷合成成功以后,通過對比合成的糖苷與噴灑了馬來酰肼煙葉中主要馬來酰肼糖苷色譜峰在色譜保留時間(4.61 min)和MRM質(zhì)譜離子對(275.2>113.1和113.1>84.9,正離子模式)的完全一致,確認(rèn)了合成的物質(zhì)為馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷。合成的馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜(全掃模式)確定其純度為82.04%(見圖2)。

圖 2 　本實(shí)驗(yàn)合成的馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的氣相色譜-質(zhì)譜全掃描色譜圖Fig. 2 　GC-MS full scan chromatogram of synthesized MH-O-β-D-glucoside　GC conditions: column, DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm); temperature program: 0-1 min, 60 ℃; 1-45 min, 60-280 ℃; 45-60 min, 280 ℃.

通過假設(shè)馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷與馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷具有相同的MRM離子對和接近的保留時間(因?yàn)閮烧邽槲恢卯悩?gòu)體),在色譜保留時間為3.71 min的位置找到了馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的候選物,通過對比馬來酰肼噴灑后的煙葉樣品和空白樣品,發(fā)現(xiàn)該候選物只存在于馬來酰肼噴灑后的煙葉樣品中,且其色譜峰面積只有相同樣品中馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷峰面積的5%～10%,與文獻(xiàn)[21]報道的馬來酰肼兩個糖苷的相對含量關(guān)系一致,綜合以上信息確定該候選物為馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷。

2.2　樣品前處理方法的篩選

研究已證明馬來酰肼施用于煙草(或其他作物)后會生成馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖和馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖[8,9],由于目前尚無這兩種糖苷的標(biāo)準(zhǔn)品可購買,文獻(xiàn)[18]報道的馬來酰肼殘留檢測方法通常先采用鹽酸將糖苷水解,然后再用色譜法測定馬來酰肼的總量(即水解測總量法)。本實(shí)驗(yàn)人工合成了馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖,在此基礎(chǔ)上從噴灑了馬來酰肼的煙葉中鑒定出馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖和馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖。因此本實(shí)驗(yàn)無需對糖苷進(jìn)行水解即可直接測定馬來酰肼及其兩個糖苷(即直接測定法)。

本實(shí)驗(yàn)對比分析了水解測總量法、直接測定法以及多種農(nóng)藥殘留測定最常用的QuEChERS法[19]對噴灑馬來酰肼27天后采集的煙葉樣品中馬來酰肼及其糖苷的提取和純化效果(圖3a),結(jié)果發(fā)現(xiàn)QuEChERS法的提取效果最差,提取物中未見馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷和馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷,馬來酰肼的峰也很弱,幾乎要被基線掩蓋。水解測總量法和本實(shí)驗(yàn)建立的直接測定法均能獲得較明顯的馬來酰肼色譜峰,且直接測定法馬來酰肼色譜峰的信號稍強(qiáng)于水解測總量法,故初步判斷直接測定法較好。

圖 3 　不同樣品前處理方法的效果比較Fig. 3 　Comparison of different sample preparation methods　a. a tobacco leaf sample on the 28th day after MH spraying; b. a blank tobacco sample; c. a blank tobacco leaf sample spiked with 1 mg/kg maleic hydrazide.

為了進(jìn)一步比較水解測總量法和直接測定法,對比分析了兩種方法處理空白基質(zhì)和其添加1 mg/kg馬來酰肼時的色譜響應(yīng)情況,結(jié)果顯示,直接測定法的空白基質(zhì)提取液響應(yīng)信號與水解測總量法相當(dāng)(見圖3b),但在空白基質(zhì)中添加1 mg/kg馬來酰肼時直接測定法提取物的馬來酰肼色譜峰的響應(yīng)信號明顯強(qiáng)于水解測總量法(見圖3c)。由于直接測定法的前處理方法僅包括萃取、離心、溶劑置換等步驟(總時間約1.5 h),較水解測總量法(包括水解反應(yīng)、固相萃取、2次定容等步驟,總時間超過4 h)顯著簡化,且本實(shí)驗(yàn)所建立的方法不受水解反應(yīng)裝置限制,較水解測總量法具有更大的處理通量,因此最終采用本實(shí)驗(yàn)建立的直接測定法。

2.3　色譜條件的篩選

文獻(xiàn)報道的基于液相色譜的馬來酰肼分離方法主要有反相色譜柱分離法[13]和多孔石墨碳色譜柱分離法[14,15]。反相色譜法是馬來酰肼分離使用較多的方法,但馬來酰肼在反相柱上保留較弱,分離效果不佳[14]。陳曉水等[14]和Wang等[15]認(rèn)為,多孔石墨碳色譜柱對煙葉中的馬來酰肼分離效果較好,但這2例多孔石墨碳色譜柱分析方法的分離時間分別達(dá)到30 min[14]和35 min[15]。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)粒徑(1.7 μm)的親水相互作用色譜柱(HILIC)在7 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了馬來酰肼及其兩個糖苷的完全分離(見圖4),大大縮短了分析時間,并提高了分析靈敏度(色譜峰更窄)。

2.4　質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),馬來酰肼的響應(yīng)強(qiáng)度隨離子源溫度的升高而升高,馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的響應(yīng)強(qiáng)度在250 ℃達(dá)到最高,馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的響應(yīng)強(qiáng)度在250 ℃達(dá)到較高的水平,隨后在250～550 ℃之間變化較小(見圖5)。馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷在溫度大于250 ℃時響應(yīng)迅速下降,其原因是在較高溫度下它會發(fā)生較大的離子源源內(nèi)裂解,失去葡萄糖基,產(chǎn)生大量的[M-162+H]+離子。因此,本實(shí)驗(yàn)針對馬來酰肼和其糖苷分別優(yōu)化了離子源參數(shù),得到馬來酰肼和其糖苷的最佳離子源溫度分別為700 ℃和250 ℃。同時實(shí)驗(yàn)還對其他離子源參數(shù)做了相應(yīng)的優(yōu)化,結(jié)果見1.4節(jié)。

圖 4 　煙葉中馬來酰肼及其糖苷的色譜圖Fig. 4 　Chromatograms of MH and its glucosides in tobacco leaf　a. spray voltage, 4000 V; source temperature, 700 ℃. b. spray voltage, 5500 V; source temperature, 250 ℃. Dotted line: chromatogram of MH-O-β-D-glucoside synthesized using the Newsome method[16].

AnalyteMatrixStandard curver2Repeatabilities*/%Intra-dayInter-dayMHnoney=55031x-1572050.99633.47.9tobacco leavesy=11770x-267300.99722.78.3MH-O-β-D-glucosidenoney=46146x-1869590.99722.55.6tobacco leavesy=6363.6x-8554.30.99713.87.1

y: peak area;x: content, mg/kg. * Intra-day and inter-day repeatabilities: relative standard deviations of triplicate detection in one day and three consecutive days, respectively, at spiked level of 40 mg/kg.

圖 5 　馬來酰肼及其糖苷的響應(yīng)隨離子源溫度的變化曲線Fig. 5 　Temperature-response curve of MH and its glucosides

2.5　方法評價

從基質(zhì)效應(yīng)、重復(fù)性、回收率、定量限、檢出限等方面評價了所建立的分析方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn),煙葉基質(zhì)對馬來酰肼及馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的基質(zhì)效應(yīng)分別為78.6%和86.2%(根據(jù)1.6節(jié)所述方法和表2校準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)計算),可見煙葉基質(zhì)對馬來酰肼及其糖苷的響應(yīng)強(qiáng)度產(chǎn)生了很大的抑制作用,但基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線仍可獲得與溶劑空白標(biāo)準(zhǔn)曲線相似的線性響應(yīng)(r2,見表2)。因此本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線對目標(biāo)分析物進(jìn)行定量,以避免基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響。

向空白煙葉樣品中分別添加10、40、80 mg/kg的馬來酰肼和馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),并同時測定日內(nèi)重復(fù)性和日間重復(fù)性。結(jié)果表明方法的重復(fù)性(見表2)和回收率(見表3)均符合歐盟委員會“食品和飼料中農(nóng)殘分析的質(zhì)量控制和方法評價指導(dǎo)文件”[22]的相關(guān)要求(回收率在70%～120%之間,重復(fù)測定RSD≤20%)。

采用逐級稀釋煙葉空白樣品中目標(biāo)分析物的方法測定方法的檢出限和定量限,結(jié)果(見表3)表明檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)均遠(yuǎn)低于CORESTA和中國煙草總公司規(guī)定的殘留水平(80 mg/kg)。

表 3 　馬來酰肼及其糖苷的回收率、檢出限和定量限

LOD:S/N=3; LOQ:S/N=10.

2.6　應(yīng)用

將所建立的方法應(yīng)用于煙葉中馬來酰肼的殘留檢測和馬來酰肼在煙葉中的代謝過程研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),噴灑后第一周即可檢測到馬來酰肼-O-β-D-葡萄糖苷和馬來酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的生成;隨著噴灑后時間的延長,糖苷含量持續(xù)上升,馬來酰肼殘留量則持續(xù)降低(見圖6)。但是,馬來酰肼糖苷的增加量遠(yuǎn)小于馬來酰肼的減少量。以噴灑后第28天為例,此時馬來酰肼的含量已由噴灑時的305.0 mg/kg降至56.8 mg/kg,即有246.4 mg/kg(占噴灑總量的80.8%)的馬來酰肼被代謝或發(fā)生了轉(zhuǎn)移。而馬來酰肼糖苷的含量此時為46.1 mg/kg,折合成馬來酰肼的含量僅為18.8 mg/kg,即減少的馬來酰肼僅有7.6%轉(zhuǎn)化成了馬來酰肼糖苷。由于噴灑實(shí)驗(yàn)時馬來酰肼只被噴灑至煙葉表面,大量損失的馬來酰肼可能轉(zhuǎn)移至根、莖等器官或經(jīng)根部轉(zhuǎn)移至土壤,也可能代謝成了其他物質(zhì)。

圖 6 　噴施馬來酰肼后煙葉中馬來酰肼及其糖苷的含量變化Fig. 6 　Content changes of MH and its glucosides in tobacco leaves sprayed with MH

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的馬來酰肼及其糖苷的定量分析方法簡單、快速、安全、靈敏度高,在樣品前處理和儀器分析方面均優(yōu)于文獻(xiàn)方法和煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。方法的建立對加強(qiáng)煙葉中馬來酰肼殘留監(jiān)控和開展馬來酰肼代謝相關(guān)研究具有重要意義。該方法也可作為其他作物中馬來酰肼殘留量測定的參考方法。