李紅英,　沈華旦,　方江濟(jì),　張靜雅,　丁曉萍*

(1. 湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院, 湖北 武漢 430075; 2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 湖北 武漢 430065; 3. 武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430070)

我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》將抗生素列為禁用物質(zhì)[1],不得在化妝品中添加使用,但由于其具有殺菌、抑菌的功效,一些不法企業(yè)在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下,在化妝品配方中非法添加抗生素類物質(zhì),長期使用這些化妝品會導(dǎo)致對抗生素的耐藥性,造成健康隱患[2,3]。近幾年,盡管國家加大了化妝品中各類禁、限用物質(zhì)的抽檢力度,但一些不法企業(yè)為了規(guī)避政府監(jiān)管,添加不在法定檢驗(yàn)方法監(jiān)測范圍內(nèi)的禁用物質(zhì),在近幾年的國家化妝品監(jiān)督抽檢計劃中,本單位多次發(fā)現(xiàn)非標(biāo)準(zhǔn)檢測方法范圍內(nèi)的禁用物質(zhì)。因此,建立簡便、高效、可靠的多成分快速檢測方法和相應(yīng)的篩查數(shù)據(jù)庫對化妝品行業(yè)的監(jiān)管和保障消費(fèi)者的使用安全具有重要的意義。

目前,有關(guān)化妝品中抗生素類物質(zhì)的檢測方法主要有高效、超高效液相色譜法[4-7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[8-13]。LC-MS/MS適用于已知目標(biāo)物的分析,在沒有標(biāo)準(zhǔn)品和短時間內(nèi)難以建立檢測方法的情況下,很難快速完成檢測。同時,由于LC-MS/MS檢測通量受四極桿掃描速度的限制,能同時檢測的目標(biāo)物數(shù)量有限[14]。近年來,兼具離子阱和高分辨質(zhì)譜平行檢測能力的線性離子阱/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(LTQ/Orbitrap MS)已在非法添加和殘留分析領(lǐng)域得到應(yīng)用[15-17]。文獻(xiàn)[18]利用LTQ/Orbitrap MS對化妝品中一些抗生素的檢測方法進(jìn)行了研究,但涉及的化合物種類較少,達(dá)不到高通量篩查的目的。

本研究運(yùn)用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)建立了同時快速篩查化妝品中66種抗生素類化合物的分析方法。通過66種抗生素類化合物的一級精確質(zhì)量數(shù)和二級碎片離子質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫,無需對照品即可完成66種抗生素化合物的快速篩查和確證。此研究提高了日常檢驗(yàn)的工作效率和化妝品安全風(fēng)險監(jiān)控水平,對保障監(jiān)管工作的順利開展和化妝品的使用安全具有重要意義。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　主要儀器與裝置

Thermo U3000 UPLC液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司); Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL組合式高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司); Thermo ST16臺式離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司); Vortex-Genic2旋渦混合器(美國Scientific Industries公司); Hyper Sonic DT-A超聲波清洗儀(鼎泰恒勝公司); 45位N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司); Milli-Q A10超純水機(jī)(美國Millipore公司); Mettler Toledo電子天平(梅特勒-托利多(上海)公司)。

1.2　主要材料與試劑

甲醇、乙腈(色譜純,Merck公司);甲酸(色譜純,阿拉丁公司)。

羥基甲硝唑、洛硝噠唑、羥甲基甲硝咪唑3種對照品購于Witega公司;硝基咪唑、異丙硝唑、二甲硝咪唑3種對照品購于德國Dr. Ehrenstorfer公司,其他12種唑類對照品購于中國食品藥品檢定研究院;磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嗪4種磺胺對照品購于中檢院,其他11種磺胺類對照品購于德國Dr. Ehrenstorfer公司;脫水差向四環(huán)素、脫水四環(huán)素等14種抗生素購于中檢院;丹諾沙星、西諾沙星、馬波沙星、奧比沙星、惡喹酸5種對照品購于德國Dr. Ehrenstorfer公司,其他14種沙星類物質(zhì)購于中國食品藥品檢定研究院。

1.3　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取各對照品約20 mg置于10 mL容量瓶中,唑類和磺胺類化合物用乙腈溶解并定容,其他化合物用甲醇溶解并定容,配成約2 g/L的單標(biāo)溶液。儲備液保存于-20 ℃的冰箱中。臨用時,根據(jù)需要逐級稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4　樣品溶液的制備

稱取0.5 g樣品置于10 mL容量瓶中,加入乙腈定容至10 mL,渦旋30 s,超聲提取20 min,必要時加氯化鈉破除乳化,離心,上清液過0.22 μm濾膜,注入質(zhì)譜儀測定。

1.5　儀器分析

1.5.1液相色譜條件

色譜柱:UPLC C18(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);流動相:0.1%(v/v)甲酸溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脫程序:0～3 min, 10%B～20%B; 3～6 min, 20%B～25%B; 6～14 min, 25%B～27%B; 14～19 min, 27%B～35%B; 19～29 min, 35%B～65%B; 29～34 min, 65%B～10%B; 34～35 min,10%B;流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫:30 ℃。

1.5.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)正離子模式;鞘氣(N2)和輔助氣(Ar)流速分別為40和10 arb(arbitrary unit);毛細(xì)管溫度300 ℃;離子源電壓2.5 kV,電流100 μA;一級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍為m/z50～800,分辨率為60 000;多級質(zhì)譜采用高能碰撞誘導(dǎo)解離(HCD)模式,依賴一級質(zhì)譜掃描中的第1到第4強(qiáng)峰,分辨率15 000; HCD裂解能量為歸一化能量40%。66種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

1.6　質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下,對66種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,將得到的精確質(zhì)量數(shù)、特征碎片離子和保留時間信息輸入TraceFinder軟件,建立篩查質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

表 1 　66種抗生素化合物的UPLC-LTQ/Orbitrap MS分析參數(shù)

表 1 　(續(xù))

2　結(jié)果與討論

2.1　樣品提取方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選取乳液類化妝品作為典型代表基質(zhì),考察在不同提取溶劑中的提取情況。分別考察了乙腈、乙腈-2%(v/v)甲酸水溶液(3∶2，v/v)、甲醇等提取溶劑對乳液類化妝品中66種化合物的提取情況,提取效率通過在0.5 g樣品中加入10LOQ(LOQ為5 μg/kg 或10 μg/kg)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)回收率來體現(xiàn),結(jié)果見圖1?？梢钥闯?對大多數(shù)化合物而言,乙腈比乙腈-2%(v/v)甲酸水溶液的提取效率略高,沙星類化合物用乙腈-2%(v/v)甲酸水溶液(3∶2，v/v)的提取效率要稍高;甲醇與乙腈的提取效率變化趨勢基本一致,乙腈的提取效率略高于甲醇。綜合考慮,選擇乙腈作為提取溶劑。

圖 1 　66種化合物在不同提取溶劑中的提取效率Fig. 1 　Extraction efficiency of the 66 antibiotics using different solvents　The extracted solution was prepared from 0.5 g of sample spiked with mixed standard solution of 66 antibiotics of 10LOQ (LOQ: 5 μg/kg or 10 μg/kg).　Compound Nos. are the same as those in Table 1.

圖 2 　66種化合物的提取離子色譜圖Fig. 2 　Extracted ion chromatograms of the 66 antibiotics

提取效率的高低除與提取溶劑有直接的關(guān)系外,超聲時間也是一個關(guān)鍵的因素。本實(shí)驗(yàn)考察了超聲時間為5、10、15、20、30 min對提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以乙腈為提取溶劑,超聲提取15 min,絕大多數(shù)化合物已達(dá)最大提取效率。

2.2　色譜條件的選擇

本研究涉及唑類、磺胺類、沙星類和其他類別抗生素的色譜分離,參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)關(guān)于這幾類物質(zhì)的檢測要求和日常對這幾類物質(zhì)的檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),采用C18柱,以乙腈和0.1%甲酸溶液作為流動相對這幾類化合物進(jìn)行測定。乙腈的洗脫能力高于甲醇,得到的峰形更為尖銳,加入甲酸可增加離子化效率。添加一定濃度的乙酸銨會改善分離度以及提高質(zhì)譜響應(yīng)值[18],但易在色譜系統(tǒng)結(jié)晶和對質(zhì)譜離子化系統(tǒng)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)在不加入乙酸銨的情況下,通過優(yōu)化梯度洗脫,使絕大多數(shù)化合物得到較好的分離,分離度滿足實(shí)驗(yàn)要求,各化合物的具體保留時間見表1,故最后選擇C18柱為分離柱,乙腈和0.1%(v/v)甲酸溶液為流動相,梯度洗脫程序見1.5.1節(jié)。各化合物的提取離子色譜圖見圖2。

2.3　質(zhì)譜條件的選擇

線性離子阱/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀可以提供碰撞誘導(dǎo)解離(CID)和HCD兩種碰撞裂解模式。在CID模式下,線性離子阱會產(chǎn)生三分之一質(zhì)量數(shù)碎片離子的損失[17,19],無法得到低質(zhì)量端碎片,而HCD模式能有效避免CID模式的這一缺陷,產(chǎn)生低質(zhì)量端碎片離子,因此,為了得到比較豐富的二級特征離子碎片并建立篩查數(shù)據(jù)庫,本研究選擇在HCD模式下對歸一化能量為25%、30%、35%、40%和45%的二級碎片離子質(zhì)譜圖進(jìn)行了優(yōu)化。通過對幾種碰撞能量下得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在碰撞能量為30%時,部分化合物產(chǎn)生了較豐富的二級碎片離子;當(dāng)碰撞能量為40%時,絕大部分化合物可以得到比較豐富的二級碎片離子,個別化合物如甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑和氟甲喹只得到較少的碎片離子,盡管這3種化合物的二級碎片離子較少,但能滿足篩查的需要[20],綜合考慮,最終選擇碰撞能量為40%的HCD作為二級碎裂模式。各化合物的二級碎片離子見表1。

2.4　篩查數(shù)據(jù)庫的建立

本研究在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)樣,通過LTQ/Orbitrap MS系統(tǒng)獲得66種化合物的保留時間、精確質(zhì)量數(shù)(m/z)及二級特征碎片離子,將上述信息輸入TraceFinder軟件中,建立各成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

依照歐盟2002/657號文件[20]對質(zhì)譜分析方法的規(guī)定, LTQ/Orbitrap MS只需一個母離子和一個子離子即可完成對目標(biāo)物質(zhì)的確證[15]。為了篩選結(jié)果的高選擇性和可靠性,本研究選擇2個以上的二級碎片離子質(zhì)譜圖作為標(biāo)準(zhǔn)參照圖。對于精確質(zhì)量數(shù)相同的同分異構(gòu)體化合物,可通過保留時間進(jìn)行區(qū)分,如磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶,分子式均為C12H14N4O4S,保留時間分別為12.60 min和17.91 min;磺胺二甲異嘧啶和磺胺二甲嘧啶,分子式均為C12H14N4O2S,保留時間分別為5.15 min和9.24 min。當(dāng)保留時間無法區(qū)分時,可通過精確質(zhì)量數(shù)和二級碎片離子質(zhì)譜圖進(jìn)行定性和確證,如弗羅沙星和諾氟沙星,保留時間均為7.74 min,精確質(zhì)量數(shù)不同,分別為370.137 3和320.140 5。若精確質(zhì)量數(shù)相同,可通過二級碎片離子進(jìn)一步確證。由表1的結(jié)果可以看出,本研究得到的數(shù)據(jù)滿足建立篩查數(shù)據(jù)庫的要求。

2.5　線性關(guān)系和檢出限

由于化妝品基質(zhì)比較復(fù)雜,存在一定的基質(zhì)效應(yīng),為消除和補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng),本研究考察了乳液類化妝品基質(zhì)中各目標(biāo)化合物的線性關(guān)系,以目標(biāo)化合物的含量(x, μg/kg)和準(zhǔn)分子離子峰面積(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,各化合物的線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.99。根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)衛(wèi)生化學(xué)檢測方法總則要求,色譜的檢出限(LOD)以3倍空白噪聲對應(yīng)的質(zhì)量或濃度表示。由于高分辨質(zhì)譜的基線噪聲非常低,以S/N方法計算出的檢出限可能與方法的實(shí)際檢測值存在差別,本研究采用基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋方法至儀器能檢出的最低含量作為各化合物的檢出限。定量限約為檢出限的3倍。66種抗生素化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限見表2。

2.6　回收率

本研究將以乳液為基質(zhì)確定的方法用于水劑、乳液和膏霜類3種基質(zhì)樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)。3種基質(zhì)中分別加入LOQ、10LOQ、30LOQ 3種含量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個水平進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明,乳液基質(zhì)、水劑和膏霜基質(zhì)的加標(biāo)回收率分別為58.2%～119.1%、60.0%～117.5%和58.8%～116.1%, RSD分別為1.03%～11.9%、1.88%～11.6%和2.09%～11.9%。上述數(shù)據(jù)表明水劑和膏霜基質(zhì)的加標(biāo)回收率和RSD均在乳液基質(zhì)結(jié)果的范圍內(nèi),表明這一方法適合水劑和膏霜基質(zhì)的篩查測定。最低回收率較低(數(shù)據(jù)為58.2%)可能與某些抗生素化合物本身的性質(zhì)有關(guān),得到的回收率范圍與文獻(xiàn)[18]基本一致。

2.7　樣品測定

本研究所用樣品為2016年監(jiān)督抽檢的49批祛痘類化妝品。《化妝品衛(wèi)生技術(shù)規(guī)范》(2015年版)甲硝唑的檢驗(yàn)方法為高效液相色譜法,以保留時間和紫外光譜圖定性,用此方法共檢出可疑樣品10批,由于化妝品基質(zhì)復(fù)雜,僅通過保留時間和光譜無法準(zhǔn)確定性,易造成假陽性。本研究通過測得的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行初篩,確定樣品中初篩檢出的化合物,然后將樣品中可疑成分的二級碎片離子圖和相應(yīng)對照品的二級碎片離子圖進(jìn)行相似度比較,若相似度達(dá)到95%,則確定樣品中添加了該化合物。采用本研究建立的方法對10批可疑樣品進(jìn)行了檢測,其中2批樣品同時檢出甲硝唑(7.2 mg/kg和8.2 mg/kg)和氧氟沙星(6.0 mg/kg和6.3 mg/kg), 1批樣品檢出克林霉素(35.2 mg/kg),樣品中幾種檢出物質(zhì)的二級碎片離子圖與對照品的相似度均在95%以上。

表 2 　66種抗生素化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

表 2 　(續(xù))

y: peak area;x: content, μg/kg.

3　結(jié)論

本研究采用乙腈超聲提取,運(yùn)用高選擇性的Orbitrap高分辨質(zhì)譜技術(shù),同時測定了化妝品中66種抗生素化合物,建立了篩查數(shù)據(jù)庫。本工作可以快速、準(zhǔn)確地篩查、確證化妝品中的抗生素類禁用化合物,大大提高了日常檢驗(yàn)的工作效率,對日常監(jiān)管檢驗(yàn)工作具有非常重要的意義。