吳姍姍,　魏纏玲,　趙麗娟,　田　央,　王富強,　龔波林

(北方民族大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院, 寧夏 銀川 750021)

磺胺類藥物(SAs)是一類廣譜抑菌藥,作為獸藥常添加于家畜飼料中以預(yù)防和治療家畜疾病。SAs可在動物體內(nèi)殘留,被人體食用后可在食用者體內(nèi)蓄積,影響健康[1]。SAs的主要檢測方法有高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[2]。但是生物樣品基質(zhì)復(fù)雜,一般凈化方法處理后樣品基質(zhì)仍較復(fù)雜,不利于色譜分析。因此,需開發(fā)一種高效的樣品凈化方法來檢測食品中SAs殘留。

限進材料(RAM)是一種可以排阻蛋白質(zhì)等大分子同時又能讓小分子進入孔內(nèi)作用位點的特殊材料[3-7],而限進材料對蛋白質(zhì)的排阻一般是通過物理或化學(xué)擴散屏障實現(xiàn)的[8]。磁分離技術(shù)是一種高效的分離純化技術(shù)[9,10],可以加快小分子從不同樣品基質(zhì)分離的速度。血清和血漿等生物樣品中包含大量的蛋白質(zhì)[11-14],這些蛋白質(zhì)會和小分子搶奪粒子表面的吸附位點,使其結(jié)合能力減弱,導(dǎo)致后續(xù)檢測出現(xiàn)基質(zhì)干擾等問題。因此將限進材料與磁分離技術(shù)結(jié)合可以有效解決上述問題,以加快小分子的分離和富集。Zhang等[15]用C18反相修飾Fe3O4磁性納米粒子,再用殼聚糖-三聚磷酸鹽高聚物或海藻酸-鋇離子聚合物進行包覆,合成磁性限進材料,并用于分析檢測水樣中的全氟化合物。張利萍等[16]制備了一種集凈化和富集為一體的限進介質(zhì)磁性微球,將其應(yīng)用于牛奶中四環(huán)素類抗生素的富集,可有效排阻蛋白質(zhì)和凈化樣品,回收率可達76.4%以上。然而上述制備過程復(fù)雜,限制了RAM的廣泛應(yīng)用。因此制備成本低廉、簡易的磁性反相限進材料對生物基質(zhì)樣品的高效分離與檢測具有重要意義。

本研究在磁性二氧化硅(Fe2O3@SiO2)內(nèi)外表面分別接枝甲基丙烯酸十八烷基酯(SMA)和甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA),GMA通過酸水解形成聚2-甲基-2-丙烯酸-2,3-二羥基丙酯(GMMA),最終制備磁性反相限進材料Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA,并將其用于固相萃取的填料,同時結(jié)合高效液相色譜,建立了檢測牛奶和牛血清中磺胺類抗生素的分析方法。

1　實驗部分

1.1　儀器、試劑與材料

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司); TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司); Rario EL Ⅱ元素分析儀(德國Elementar公司); VSM 7404振動樣品磁強計(VSM，美國Lakeshore公司); JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM,日本JEM公司); JSM-7500F掃描電子顯微鏡(SEM,日本JEOL公司); Dmax2200pc型X射線衍射儀(日本理學(xué)公司)。

FeCl356H2O、聚乙二醇-400(PEG-400)(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠);硅酸四乙酯(TEOS)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、甲氧芐啶(TMP)、磺胺異惡唑(SIZ)、磺胺二甲氧基嘧啶(SDM)、SMA、2,2-聯(lián)吡啶(Bpy)、GMA、牛血清白蛋白(BAS)均購自上海晶純試劑有限公司。牛奶和牛血清樣品由當?shù)嘏鎏峁?。其他試劑均為分析純?/p>

1.2　磁性反相限進材料的制備

1.2.12-溴異丁酰溴氨丙基Fe2O3@SiO2(Fe2O3@SiO2-Br)的制備

參照王松威等[17]的方法制備Fe2O3@SiO2:稱取2.7 g FeCl356H2O和1.6 g NaOH,加入3.5 mL PEG-400,混合,研磨20 min,產(chǎn)物用無水乙醇洗滌后磁場分離,于60 ℃真空干燥,然后于600 ℃焙燒1 h,即得Fe2O3。稱取1.0 g Fe2O3,加入10 mL水和40 mL無水乙醇,超聲10 min,加入6.5 mL濃氨水和5.0 mL TEOS乙醇溶液(0.5 mL TEOS溶于4.5 mL無水乙醇中),反應(yīng)8 h后用無水乙醇洗滌,外磁場下分離,得到Fe2O3@SiO2。

參照魏纏玲等[18]的方法對Fe2O3@SiO2進行改性:稱取3.0 g Fe2O3@SiO2,加入26.5 mL干燥甲苯和5.6 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷,用甲苯洗滌并干燥后得到氨丙基Fe2O3@SiO2(Fe2O3@SiO2-NH2)。稱取3.0 g Fe2O3@SiO2-NH2,加入27.5 mL四氫呋喃、2.4 mL三乙胺和1.7 mL 2-溴異丁酰溴,產(chǎn)物用丙酮洗滌并干燥后,得到Fe2O3@SiO2-Br。

1.2.2Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA的制備

稱取35.0 mL甲苯和11.5 mL SMA,預(yù)聚合反應(yīng)4 h,加入2.0 g Fe2O3@SiO2-Br、143 mg CuBr和312 mg BPy,充氮氣40 min后反應(yīng)20 h,產(chǎn)物用甲醇洗滌至抽濾液無綠色,真空干燥后得到內(nèi)表面接枝SMA的Fe2O3@SiO2(Fe2O3@SiO2-SMA)。

稱取37.5 mL異丙醇和1.5 mL GMA,加入1.3 g Fe2O3@SiO2-SMA、40 mg CuBr和128 mg BPy,充氮氣40 min后反應(yīng)20 h,產(chǎn)物用異丙醇洗滌干燥,得到外表面接枝GMA的Fe2O3@SiO2-SMA(Fe2O3@SiO2-SMA-GMA)。

取適量Fe2O3@SiO2-SMA-GMA,加入0.1 mol/L硫酸水解,反應(yīng)后產(chǎn)物用乙醇洗滌并干燥,得到磁性反相限進材料Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA。

1.3　磁性反相限進材料的分離富集性能

1.3.1對牛血清白蛋白的排阻性能

Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA經(jīng)過甲醇-冰乙酸(8∶2, v/v)索氏提取24 h后得到開環(huán)Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA,稱取各200 mg開環(huán)與未開環(huán)(未經(jīng)上述索氏提取)的Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA,分別填入固相萃取柱空管內(nèi),分別用4 mL甲醇和4 mL水對固相萃取柱進行活化,量取4 mL 1 mg/mL BSA溶液上樣,于275 nm處檢測流出液中牛血清白蛋白的吸光度。

圖 1 　磁性反相限進材料的制備路線Fig. 1 　Synthesis route of magnetic reversed-phase restricted access material　SI-ATRP: surface-initiation atom transfer radical polymerization; GMA: glycidylmethacrylate; SMA: stearyl methacrylate; GMMA: glycerylmethacrylate.

1.3.2對SAs的吸附性能

配制濃度為0.5 mmol/L的SDM、SIZ和SMR溶液和1.0 mmol/L的TMP溶液,于4 ℃冰箱保持待用。稱取20 mg Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA若干份,分別添加10 mL不同濃度的TMP、SMR、SIZ和SDM溶液,室溫下振蕩吸附16 h。于270 nm測定SIZ、SDM和SMR,于290 nm測定TMP。平衡吸附量(Q, mg/g)通過公式(1)計算:

Q=(C0-Ce)V/m

(1)

其中,C0和Ce分別表示SAs的起始濃度和平衡濃度(mmol/L);V為溶液體積(L),m為磁性反相限進材料的質(zhì)量(g)。

1.4　牛奶和牛血清中SAs的測定

牛奶樣品:稱取2 g牛奶樣品,加入10 mol/L的SIZ、SMR和SDM混合標準溶液1.0 mL,再加入20 mL乙腈,以4 000 r/min離心10 min,上清液過0.22 μm有機濾膜。用Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA吸附劑對牛奶樣品進行分離純化,振蕩吸附16 h,待分析。

牛血清樣品:牛血清樣品解凍后用等體積的水稀釋,過0.45 μm水相濾膜,備用。稱取2 g牛血清樣品,加入10 mol/L的SIZ、SMR和SDM混合標準溶液1.0 mL,用Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA吸附劑對牛血清進行分離純化,振蕩吸附8 h,待分析。

1.5　色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm,美國安捷倫公司);流動相:0.1%(v/v)乙酸水溶液-乙腈(60∶40, v/v);流速:0.8 mL/min;等度洗脫;進樣量:25 μL。

2　結(jié)果與討論

2.1　磁性限進材料的表征

在Fe2O3上包覆二氧化硅形成Fe2O3@SiO2微球,將Fe2O3@SiO2改性后采用表面原子轉(zhuǎn)移自由基聚合技術(shù)(SI-ATRP)在Fe2O3@SiO2上逐層接枝SMA和GMA,得到Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA,具體制備過程見圖1。

圖 2 　Fe2O3@SiO2的(a)透射電鏡圖和(b)掃描電鏡圖Fig. 2 　(a) Transmission electron micrograph and (b) scanning electron micrograph of Fe2O3@SiO2

2.1.1掃描電鏡和透射電鏡分析

利用SEM和TEM對Fe2O3@SiO2進行表征,從圖2a透射電鏡圖可以看出,Fe2O3納米顆粒的表面成功包覆了一層SiO2, Fe2O3@SiO2呈核-殼結(jié)構(gòu)的球形結(jié)構(gòu);從圖2b掃描電鏡圖可以看出,合成的Fe2O3@SiO2形貌為大小均勻的球形,具有良好的分散性。

2.1.2振動磁強計分析

采用VSM分析了Fe2O3@SiO2和Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA的磁學(xué)性能(見圖3)。結(jié)果表明,Fe2O3@SiO2的飽和磁化率為14.87 emu/g,與文獻[19]報道的磁化率值接近;Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA飽和磁化率為6.91 emu/g,與Fe2O3@SiO2相比略有減小,是因為Fe2O3@SiO2內(nèi)外表面接枝了SMA和GMA,從而影響其磁響應(yīng)性能。在沒有外加磁場時,Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA均勻地分散在乙醇溶液中,呈紅棕色懸浮液;當磁場存在時,磁性反相限進材料在20 s內(nèi)快速吸附到內(nèi)壁,使溶液變得透明,說明Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA具有良好的磁響應(yīng)性能,可作為磁性分離載體。

圖 3 　Fe2O3@SiO2和Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA的磁滯回線Fig. 3 　Hysteresis loops of Fe2O3@SiO2 and Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA

圖 4 　(a)Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA和(b) Fe2O3@SiO2的 X射線衍射譜圖Fig. 4 　X-ray patterns of (a) Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA and (b) Fe2O3@SiO2

2.1.3X射線衍射分析

Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA(見圖4a)和Fe2O3@SiO2(見圖4b)均出現(xiàn)了9個分別位于24.07°、33.05°、35.62°、40.74°、49.39°、53.87°、57.35°、62.36°和63.98°的Fe2O3特征衍射峰,這些峰值分別歸屬于Fe2O3在(012)、(104)、(110)、(113)、(024)、(116)、(122)、(214)和(300)處的特征峰,可見接枝SMA和GMA后,Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA晶型結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生變化,只是影響其X射線衍射峰的強度。如圖4所示,于24°出現(xiàn)了二氧化硅的無定形衍射峰,說明Fe2O3表面成功包覆了SiO2。

2.1.4元素分析

對Fe2O3@SiO2-Br、Fe2O3@SiO2-SMA、Fe2O3@SiO2-SMA-GMA和Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA進行元素分析表征,具體結(jié)果見表1。與Fe2O3@SiO2-Br相比,Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA中SMA和GMA單體的成功接枝使C和H的相對含量明顯增多。

2.2　磁性反相限進材料對牛血清白蛋白排阻性能的考察

按1.3.1節(jié)描述進行操作,考察磁性反相限進材料對牛血清白蛋白的鍵合率(見表2),鍵合率越低說明排阻性能越好。由表2可知,開環(huán)與未開環(huán)的Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA與牛血清白蛋白鍵合率的平均值分別為9.6%和53.3%,對牛血清白蛋白的排阻能力分別為90.4%和46.7%,說明兩種狀態(tài)的限進材料對蛋白質(zhì)均具有排阻能力,這是由于GMA成功接枝到Fe2O3@SiO2外表面,使其外表面具有親水性,而開環(huán)Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA對蛋白質(zhì)的排阻能力要優(yōu)于未開環(huán)的Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA。

表 2 　Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA對牛血清白蛋白的排阻能力

圖 5 　Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA對磺胺異噁唑、 磺胺二甲氧嘧啶、甲氧芐啶和磺胺甲基嘧啶的吸附曲線　Fig. 5 　Adsorption curves of sulfisoxazole (SIZ), sulfadimethoxine (SDM), trimethoprim (TMP) and sulfamerazine (SMR) on Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA

2.3　磁性反相限進材料對SAs吸附性能的考察

利用靜態(tài)吸附平衡試驗檢測磁性反相限進材料對SIZ、SDM、TMP和SMR的吸附性能,結(jié)果如圖5所示,Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA對SIZ、SDM、TMP和SMR的吸附量隨濃度的增加而逐漸增大,且增至一定濃度時吸附量趨于平衡,最大吸附量分別為2.76、2.24、1.51和1.34 mg/g。SIZ、SDM、TMP和SMR均具有疏水性,但由于SMA接枝到Fe2O3@SiO2內(nèi)表面,使其對4種SAs具有一定的吸附性能。曹慧等[20]制備的磁性多壁碳納米管對SDM、SIZ的吸附量分別為1.982 mg/g 和1.748 mg/g,可以看出,Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA對SDM和SIZ的吸附性能更好。

2.4　方法學(xué)評價

2.4.1線性范圍

對SIZ、SMR和SDM混合標準溶液進行分析,以SIZ、SMR和SDM的質(zhì)量濃度為橫坐標(X, μg/L),對應(yīng)的峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線(見表3)。結(jié)果表明,SIZ、SMR和SDM在各自的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.982 8～0.991 1。

表 3 　SIZ、SMR和SDM的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.4.2回收率與精密度

在空白牛奶和牛血清樣品中分別添加0.5 mg/L的磺胺類藥物標準溶液進行加標回收試驗,SIZ、SMR和SDM在牛奶和牛血清樣品中的加標回收率和相對標準偏差(見表4)。采用Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA進行SPE時,SIZ、SMR和SDM的回收率為88.7%～90.8%;采用Fe2O3@SiO2進行SPE時,SIZ、SMR和SDM的回收率為19.6%～30.7%,說明Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA對疏水性小分子具有良好的富集和分離作用。

表 4 　牛奶和牛血清樣品中SIZ、SMR和SDM的加標回收率和相對標準偏差(n=5)

圖 6 　(a)空白樣品和加標樣品經(jīng)(b)Fe2O3@SiO2和(c) Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA萃取后的色譜圖　Fig. 6 　Chromatograms of (a) blank samples, and spiked samples extracted with (b) Fe2O3@SiO2, (c) Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA

2.5　實際樣品分析

按1.4節(jié)和1.5方法檢測牛奶和牛血清樣品中的SIZ、SMR和SDM,空白牛血清樣品和加標樣品經(jīng)Fe2O3@SiO2和Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA固相萃取后的色譜圖見圖6?？梢钥闯?空白牛血清樣品中未檢測到SIZ、SMR和SDM;而采用Fe2O3@SiO2和Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA作為SPE填料進行萃取后,檢測出了SIZ、SMR和SDM,但Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA作為SPE填料時SIZ、SMR和SDM的色譜響應(yīng)更高。

3　結(jié)論

本文通過SI-ATRP將SMA和GMA接枝到改性后的Fe2O3@SiO2內(nèi)外表面,使其內(nèi)表面疏水、外表面親水,相比其他填料,Fe2O3@SiO2-SMA-GMMA的親水性外表面可防止樣品基質(zhì)中大分子蛋白質(zhì)在表面發(fā)生不可逆吸附,延長使用壽命。磁性反相限進材料內(nèi)表面吸附目標分析物后易通過外磁場收集,可省去離心和過濾等過程,簡化生物樣品的前處理過程,對含有大量蛋白質(zhì)的復(fù)雜生物樣品前處理和藥物小分子的檢測方面具有十分重要的意義。