田尉婧,　張九凱,　程海燕,　李　鮮,　陳　穎*

(1. 中國檢驗檢疫科學研究院, 北京 100176; 2. 浙江大學園藝系, 浙江省園藝植物整合生物學研究與應用重點實驗室, 浙江 杭州 310058; 3. 上海愛博才思分析儀器貿易有限公司, 北京 100102; 4. 中華全國供銷合作總社北京商業(yè)機械研究所, 北京 100070)

1　蛋白質組學概況

蛋白質組(proteome)由澳大利亞科學家Marc Wilkins和Keith Williams[1]于1994年提出,1995年報道于Electrophoresis雜志。蛋白質組是一個基因組或一個細胞、組織表達的所有蛋白質,會隨著環(huán)境、時間、地點等因素的改變而改變。蛋白質組的提出標志著蛋白質組學(proteomics)的誕生,蛋白質組學研究特定條件下蛋白質整體水平的存在狀態(tài)及活動規(guī)律[2],從蛋白質水平上對蛋白質的作用模式、功能機理、調節(jié)控制以及蛋白質間的相互作用進行探索。

根據(jù)研究目的不同,蛋白質組學的研究內容主要包括:鑒定特定細胞、組織或器官的蛋白質種類(定性蛋白質組學)、探究特定條件下蛋白質表達量變化(定量蛋白質組學)、揭示蛋白質間的復雜相互作用機制(互作蛋白質組學)、明確蛋白質在生命活動中執(zhí)行的功能(功能蛋白質組學)、描繪蛋白質的二維、三維或四維結構(結構蛋白質組學)以及蛋白質翻譯后的修飾(修飾蛋白質組學)[3]。

目前,蛋白質組學研究方法主要有兩種,即基于凝膠(gel-based)的方法和基于質譜(MS-based)的方法。雙向凝膠電泳(2-DE)是較早發(fā)展起來的一項分離技術,可以追溯至20世紀70年代,其原理是:第一向基于蛋白質等電點不同進行等電聚焦分離,第二向依據(jù)蛋白質相對分子質量差異,利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將其在二維平面上分開。該方法是經典的蛋白質研究技術,廣泛應用于食品安全領域的研究。盡管如此,凝膠法存在較多缺點,如對低豐度蛋白質、疏水性蛋白質、極酸或極堿蛋白質的分離和檢測效果較差,且難以實現(xiàn)規(guī)?；妥詣踊?。質譜技術的出現(xiàn)解決了這一問題。質譜具有快速、靈敏、準確的優(yōu)點,可應用于蛋白質的識別鑒定(定性和定量)、翻譯后修飾、表達差異分析、功能及互作分析等[3]。目前有多種質譜技術應用于蛋白質組學研究,如基質輔助激光解吸電離(MALDI)和電噴霧電離(ESI)等。質譜法是進行高通量蛋白質鑒定和定量分析的最常用方法,可以同時檢測千余種蛋白質,其與同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)等技術及生物信息學的結合應用促進了蛋白質組學的快速發(fā)展。凝膠法和質譜法在很多方面可互補不足,研究中多將兩者結合應用。

蛋白質組學自興起以來發(fā)展迅速,應用對象涉及微生物[1,4]、動物[5-7]和植物[8-11],應用領域包括藥物開發(fā)[12]、病理研究[13-17]等,在食品品種、產地、生產加工及果實成熟度、外源處理等方面的研究也屢見不鮮[6-10,18]。此外,蛋白質組學可應用于研究潛在的蛋白質或多肽標志物,加快了食品真?zhèn)舞b別的發(fā)展。

2　研究流程

根據(jù)質譜分析水平是基于完整蛋白質還是多肽碎片,蛋白質組學研究流程分為Bottom-up型和Top-down型(見圖1)。在Bottom-up型研究流程中,蛋白質經胰蛋白酶等酶水解,所得肽段用于質譜分析[3],這種方法也稱為肽蛋白質組學。Bottom-up型可根據(jù)蛋白質是否進行分離而分為兩類,第一類流程中利用凝膠電泳分離獲得目標蛋白質,并對其進行酶解;另一類方法是“鳥槍法”(shotgun),對未經分離的蛋白質混合物進行酶解,肽段混合物經色譜及質譜進行分析,在這個過程中需根據(jù)肽段混合物的復雜度而選擇恰當?shù)纳V分離體系,如液相色譜、多維色譜等。Bottom-up型應用廣泛,可對蛋白質進行定性及定量分析。在Top-down型研究流程中,蛋白質不經酶解,直接被質譜解離為碎片而進行分析,該方法受限于儀器設備,目前應用相對較少。

圖 1 　蛋白質組學研究流程Fig. 1 　Workflows of proteomics research　PMF: peptide mass fingerprint; 2-DE: two-dimensional gel electrophoresis; 1-DE: one-dimensional gel electrophoresis; MALDI-TOF-MS: matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry; LC-CE: liquid chromatography-capillary electrophoresis; SCX-RPLC: strong cation exchange and reversed-phase liquid chromatography; iTRAQ: isobaric tags for relative and absolute quantification; TMT: tandem mass tags; MRM: multiple reaction monitoring; SWATH: sequential window acquisition of all theoretical fragment ions.

蛋白質組學研究流程包括樣品制備、蛋白質分離、蛋白質鑒定或定量以及生物信息學分析等主要步驟(見圖1),其中蛋白質的分離、定性或定量及結構、功能等生物信息學分析是蛋白質組學研究的核心和關鍵。

樣品在進入質譜前,需在蛋白質或多肽水平上進行分離,往往要求分辨率高、可重復性好,以保證蛋白質較好地分離和數(shù)據(jù)的可靠。蛋白質組分離多采用凝膠電泳和液相色譜的方法。

凝膠電泳包括一維凝膠電泳(1-DE)和2-DE等。1-DE通過高選擇性的親和力將蛋白質分離,能將蛋白質溶解于十二烷基硫酸鈉中,所覆蓋的蛋白質范圍較廣(相對分子質量為1×104～3×105Da),極酸性和極堿性的蛋白質易被分離[3]。利用2-DE分離蛋白質需要兩步,第一步為等電聚焦電泳,根據(jù)等電點將蛋白質分離;第二步為SDS-PAGE,根據(jù)蛋白質相對分子質量的差異將其分離。根據(jù)凝膠的大小和pH梯度,通常情況下2-DE可分離2 000種蛋白質,甚至能分離多達5 000種蛋白質[19]。

常用液相色譜技術包括反相液相色譜(RPLC)以及二維或多維液相色譜。RPLC的原理是其固定相可與被分離的蛋白質發(fā)生作用,初始洗脫液中有機相濃度較低,蛋白質與固定相作用強于流動相與固定相作用而被固定相吸附;當洗脫液中有機相濃度增加到一定程度,流動相與固定相間作用較強,致使蛋白質與固定相脫離,蛋白質疏水性越弱,其保留時間越短。二維或多維液相色譜根據(jù)蛋白質在不同相態(tài)的差異性分布,利用多通閥、切換閥、色譜柱等設備,在兩個或多個色譜體系中將蛋白質分離,常用技術有多維高效液相色譜、多維高效液相色譜-毛細管電泳聯(lián)用等。液相色譜技術具有靈敏度高、分析速度快、易于自動化、可與質譜檢測技術聯(lián)用等優(yōu)點,可對復雜蛋白質樣品進行分離[20]。

3　蛋白質組學的定性和定量研究

蛋白質的定性和定量研究作為蛋白質組學的兩個研究方向,是表達差異分析、相關性分析、品質比較等工作開展的基礎與前提。

3.1　蛋白質定性研究

蛋白質定性研究是確定蛋白質本質屬性的研究,基于質譜的蛋白質定性研究技術主要以肽質量指紋圖譜(PMF)和“鳥槍法”為主。

PMF的原理是:蛋白質的氨基酸序列不同,當?shù)鞍踪|被分解為肽段后,產生的肽段質量數(shù)也不同,這些肽段的質量即為指紋圖譜。PMF核心技術是2-DE和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)。2-DE將蛋白質分離,選擇蛋白質膠點并水解為多肽片段,經MALDI-TOF-MS檢測獲得相對分子質量,通過PMF數(shù)據(jù)庫分析以鑒定蛋白質(見圖1)。MALDI利用脈沖激光束照射樣品與基質形成的晶體結構,基質吸收激光能量傳遞給樣品分子使其電離,離子在電場作用下通過飛行管道,檢測器依據(jù)離子質荷比和飛行時間進行檢測[21]。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準確度高、分辨率高等優(yōu)點,是研究高分子化合物的有力工具。

“鳥槍法”是指樣品經酶水解為肽段混合物,利用串聯(lián)質譜(MS/MS)檢測,計算機預測每個肽段在蛋白質中的位置,得到蛋白質序列并進行數(shù)據(jù)庫搜索,實現(xiàn)蛋白質的鑒定[22]?！傍B槍法”的關鍵步驟是實現(xiàn)肽段混合物的高度分離,液相色譜-毛細管電泳聯(lián)用(LC-CE)、強陽離子交換柱-反相液相色譜聯(lián)用(SCX-RPLC)等分離效果較好的二維色譜技術在“鳥槍法”中應用廣泛。

蛋白質定性還可通過其他技術實現(xiàn),如de novo測序和肽段碎片離子鑒定法(PFI)等。de novo測序即從頭測序,指在不需要任何參考序列的情況下,利用串聯(lián)質譜或MALDI-TOF-MS等技術對肽段測序,將所得序列進行拼接、組裝,繪制蛋白質序列圖譜。目前de novo測序在生命研究中有一定的應用[23],在食品真?zhèn)舞b別及品質識別方面應用前景仍舊廣闊。

3.2　蛋白質定量研究

常用蛋白質定量技術包括iTRAQ、串聯(lián)質譜標記(TMT)、多反應監(jiān)測(MRM)、連續(xù)窗口采集技術(SWATH)、細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記(SILAC)、非標記(Label-free)等。

iTRAQ技術是研究蛋白質表達差異、發(fā)現(xiàn)生物標志物的常用技術,是應用最廣泛的體外標記技術。該技術利用多種同位素標記蛋白質多肽N末端或賴氨酸側鏈基團,經質譜分析可同時比較4個或8個樣品之間的蛋白質表達量。iTRAQ試劑包括3個化學基團,分別是報告基團、平衡基團和反應基團,反應基團通過與肽段特異性結合連接到肽段上[24]。報告基團和平衡基團的總質量數(shù)不變[24,25],因此被標記的不同樣品同一蛋白質的同一肽段在一級質譜中表現(xiàn)為一個峰;平衡基團在質譜儀碰撞室內丟失,報告基團產生相應的報告離子,代表相應蛋白質或肽段,進而定量。iTRAQ定量技術操作簡單,可與分離技術及質譜技術結合應用。

TMT技術是多肽體外標記定量技術,利用等壓定量標記試劑在單一實驗中可以分析多達10個樣本。TMT定量原理類似于iTRAQ技術,2重、6重及10重TMT技術分別通過加入1個13C、5個13C或15N及8個13C或15N的穩(wěn)定同位素對樣品進行定量[26,27]。TMT技術在食品真?zhèn)舞b別及品質識別的應用不如iTRAQ廣泛,有待進一步發(fā)展。

MRM技術是基于三重四極桿質譜儀的串聯(lián)質譜法,多用于小分子定量檢測[28]。質譜儀通過MRM模式進行掃描,監(jiān)測樣品的多肽母離子和子離子信息,若出現(xiàn)符合規(guī)則的母離子/子離子對,儀器將切換至串聯(lián)質譜模式,符合規(guī)則的母離子進入碰撞室發(fā)生碰撞,符合規(guī)則的子離子信號被記錄,進行分子鑒定分析。MRM通過對母離子和子離子的兩次篩選,減小了化學背景,降低了化學干擾,提高了靈敏度[29]。此外,MRM技術具有通量高、重復性好、準確度高的特點[30],與其他技術結合使用,可使復雜目標物的定性、定量更加可靠。

SWATH技術是新型蛋白質全景定量技術,具有靈敏度高、分辨率高、掃描速度快、線性動態(tài)范圍廣、外標校正準確度高等特點[31,32]。SWATH工作流程大體分為數(shù)據(jù)采集、蛋白質鑒定、質譜峰提取及數(shù)據(jù)分析。在設置的掃描范圍內Q1以25 Da的間隔連續(xù)將母離子傳輸?shù)絈2內解離,碎片離子經飛行管道被檢測器捕獲,獲得不同肽段的質譜圖譜。SWATH技術可用于定量分析及鑒定蛋白質復合體、蛋白質翻譯后修飾,發(fā)展前景廣闊。

Label-free技術常用于分析大量蛋白質的質譜數(shù)據(jù),利用蛋白質相應肽段的質譜峰強度或蛋白質的二級譜圖數(shù)定量蛋白質[33]。Label-free技術無需同位素標簽作內標,耗費較低。SILAC技術是一種體內標記技術,利用同位素標記培養(yǎng)基中的必需氨基酸,同位素標記隨著氨基酸進入細胞,進而對細胞進行定量分析[34]。SILAC法只適用于體外培養(yǎng)的細胞標記,成本較高。

4　生物信息學的應用

20世紀90年代,人類基因組計劃的實施引發(fā)了生物信息學(bioinformatics)的發(fā)展,使蛋白質分析發(fā)生了革命性的變化,為高通量蛋白質組學的發(fā)展鋪平了道路。生物信息學以生物數(shù)據(jù)為研究材料,以計算機為研究工具,利用統(tǒng)計學、應用信息學等方法研究生物學問題,更加直觀地闡述實驗結果及結論。生物信息學是生命科學和信息科學等學科相結合的交叉學科,涉及數(shù)據(jù)庫搜索、數(shù)據(jù)處理及軟件處理等。

4.1　蛋白質數(shù)據(jù)庫

通過蛋白質數(shù)據(jù)庫,利用鑒定工具對蛋白質進行鑒定是蛋白質組學研究的重要內容。一些常見蛋白質數(shù)據(jù)庫見表1。

蛋白質數(shù)據(jù)庫涵蓋了蛋白質的諸多信息,包括名稱、序列、空間結構、功能、分類、轉錄后修飾、互作位點及代謝途徑等,可分為綜合性數(shù)據(jù)庫、序列數(shù)據(jù)庫、結構數(shù)據(jù)庫、通路分析數(shù)據(jù)庫、互作數(shù)據(jù)庫以及蛋白質鑒定數(shù)據(jù)庫(見表1)。綜合性數(shù)據(jù)庫涵蓋較全面。UniProt是目前信息最豐富、資源最廣的蛋白質數(shù)據(jù)庫之一,由UniProtKB(含SWISS-Prot及TrEMBL)、UniRef、UniParc及Proteomes 4大模塊組合而成,其蛋白質序列主要來源于基因組測序[35,36]。ExPASy也是常用的綜合性數(shù)據(jù)庫,由瑞士生物信息學研究所創(chuàng)建,涉及了基因組、蛋白質組、轉錄組等領域,涵蓋了SWISS-PROT、PROSITE和TrEMBL等數(shù)據(jù)庫,提供了AACompIdent、TagIdent和ProtParam等多個鑒定工具[37]。

SWISS-PROT和PIR是兩大蛋白質序列數(shù)據(jù)庫。SWISS-PROT由日內瓦大學醫(yī)學生物化學系和歐洲生物信息學研究所共同維護,每個蛋白質條目包含序列、引用文獻、分類、功能、轉錄后修飾、特殊位點和區(qū)域及分子結構等信息[38]。PIR是一個全面經注釋的非冗余序列數(shù)據(jù)庫,由蛋白質序列數(shù)據(jù)庫PIR-PSD、蛋白質分類數(shù)據(jù)庫iProClass及非冗余的蛋白質參考資料數(shù)據(jù)庫PIR-NREF組成,交叉的數(shù)據(jù)庫達90多個,提供了全面、及時的蛋白質信息[39]。

蛋白質結構數(shù)據(jù)庫PDB發(fā)展速度迅速,貯存著由X射線、核磁共振等方法獲得的蛋白質三維結構信息[40]。

通路分析數(shù)據(jù)庫多用于檢索蛋白質參與的代謝途徑以及可能發(fā)揮的功能,KEGG是常用數(shù)據(jù)庫之一,由日本京都大學生物信息學中心于1995年建立,是提供分子水平信息的實用數(shù)據(jù)庫[41,42]。

STRING是搜尋已知蛋白質和未知蛋白質間相互作用的數(shù)據(jù)庫,包括物理作用和功能作用。STRING包含實驗數(shù)據(jù)、實驗結果及預測結果等,利用打分機制對預測結果賦予權重,計算分值[43]。

隨著蛋白質組學的發(fā)展,利用蛋白質鑒定數(shù)據(jù)庫可以確定蛋白質種類、名稱、功能等信息,成為蛋白質研究中的常用手段。MASCOT是目前使用最廣泛的蛋白質鑒定數(shù)據(jù)庫之一,是基于質譜數(shù)據(jù)的蛋白質鑒定系統(tǒng),可輸入肽質量指紋圖譜、肽段序列、氨基酸組成、串聯(lián)質譜原始數(shù)據(jù)等內容進行檢索[44]。BLAST和FASTA是常用的對比程序,可在數(shù)據(jù)庫中搜索相似的序列,其中FASTA比BLAST敏感度高、耗時長。此外,TagIdent、PepMapper和Pep-tideSearch等均是常用的蛋白質鑒定數(shù)據(jù)庫(見表1)。

表 1 　常見蛋白質數(shù)據(jù)庫

表 1 　(續(xù))

4.2　數(shù)據(jù)處理及軟件

蛋白質組學質譜數(shù)據(jù)具有關系復雜、數(shù)據(jù)量大、查詢方式多等特點,在研究蛋白質組學質譜數(shù)據(jù)時需要進行大數(shù)據(jù)處理及軟件分析。常用的蛋白質組學生物數(shù)據(jù)處理包括質控、篩選、同源映射、功能分析、選擇方向和模型構建等,分別由不同軟件完成。

質控指為達到規(guī)范或規(guī)定對數(shù)據(jù)質量要求采取的技術和措施,可用于驗證生物學重復或實驗重復數(shù)據(jù)的可靠性。MeV等軟件進行的聚類分析、SIMCA軟件進行的主成分分析等無監(jiān)督分析及偏最小二乘法判別分析、正交偏最小二乘法判別分析等有監(jiān)督分析均屬于質控分析。蛋白質原始數(shù)據(jù)的篩選分為可信蛋白質的篩選和差異蛋白質的篩選,可信蛋白質的篩選常用分析標準有FDR標準、Unused標準和肽段標準,差異蛋白質的篩選常用分析標準有倍數(shù)標準、P值標準和雙標準。

利用同源映射分析方法,未知蛋白質通過與近緣模式物種的已知蛋白質氨基酸序列進行對比可確定其分類,目前NCBI在線BLAST是最常用的方法之一。蛋白質功能分析包括基因本體(gene ontology, GO)分析、途徑分析和蛋白-蛋白互作分析。基因本體涉及細胞組分、分子功能、生物過程,利用DAVID等軟件通過基因本體分析可對蛋白質進行生物學分類。類似的,蛋白質經途徑分析、蛋白-蛋白互作分析可分別確定其參與的生物體代謝途徑及蛋白質互作成員和方式,常用工具有KEGG和STRING。

實驗中所得的差異蛋白質數(shù)據(jù)往往多且散,需依據(jù)功能分析結果及研究目的進行重點分析,如利用Powerpoint、VennDiagrams或Winvenn等軟件繪制文氏圖,選擇組內特有蛋白質或者組間共有蛋白質進行重點分析,又如根據(jù)MeV、cluster、R語言等軟件繪制熱圖,選擇具有相同或特有表達模式的蛋白質進行重點分析。利用Pathway builder、Cytoscape等工具對選擇的重點內容進行模型構建,可直觀描述機理機制。

5　在食品真?zhèn)舞b別及品質識別中的應用

隨著食品產業(yè)規(guī)模擴張以及食品供應鏈發(fā)展,以經濟利益為驅動的食品摻假現(xiàn)象屢見不鮮,正成為一個全球性話題。食品摻假手段從最初的缺斤少兩、稀釋勾兌等簡單手段發(fā)展為利用現(xiàn)代食品科學技術“棄真存?zhèn)巍钡刃问?包括原料品質以次充好、摻入劣質品或違禁成分、冒充或虛標原產地、假冒物種或品種等[18,45]。食品摻假現(xiàn)象不僅影響消費者權益,影響食品產業(yè)信譽,還關系著安全問題。未標識的食品成分往往會成為潛在的安全隱患,如過敏原及有毒成分會影響消費者的健康,錯誤的標簽也可能會違背特定群體的飲食習慣。因此,急需準確有效的檢測技術對食品的真實屬性進行有效鑒定。

目前,食品真?zhèn)舞b別技術主要包括理化分析技術、分子生物技術、蛋白質技術、人工智能、形態(tài)學分析和感官分析等6大類[46]。其中,蛋白質組學技術近幾年得以迅速發(fā)展,高分辨質譜以及現(xiàn)代生物信息學技術的發(fā)展使蛋白質組學在食品真?zhèn)舞b別及品質識別研究中具有重要地位[18]。

目前,蛋白質組學已在物種鑒別、產地溯源、品質識別、摻假鑒定等多個領域得以應用,涉及肉制品、水產品、乳制品、果蔬制品、谷物及其制品、高附加值食品及保健食品等多類食品[5,18,47-51](見表2)。研究中常利用2-DE、SDS-PAGE等凝膠電泳技術或液相色譜等分離技術,及MALDI-TOF-MS、LC-ESI-MS/MS等質譜技術,或進一步結合iTRAQ、免疫印跡等定性/定量技術,對研究對象的特定蛋白質或蛋白質組進行分離、鑒定或/和定量,達到真?zhèn)舞b別或品質識別的目的[9,52-54](見表2)。

表 2 　基于質譜的蛋白質組學在食品真?zhèn)舞b別和品質識別的應用

表 2 　(續(xù))

LIEF: liquid-phase isoelectric focusing; DESI-MS: desorption electrospray ionization mass spectrometry; LESA-MS: liquid extraction surface analysis mass spectrometry; SMIM: selected MS/MS ion monitoring; SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SRM: selective reaction monitoring; nESI-IT: nanoelectrospray ion trap; MRJP5: major royal jelly protein 5; PPI: protein-protein interaction network; ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay; TnI: troponin I.

5.1　物種鑒別

利用蛋白質組學可對農作物、營養(yǎng)品、肉類等進行物種鑒別。

利用2-DE分離技術及質譜檢測技術,發(fā)現(xiàn)高蛋白大豆及高油大豆間存在40個表達差異的蛋白質,且儲存相關蛋白質、碳氮代謝相關蛋白質及氧化應激蛋白質在高蛋白大豆中表達較強[47]。

Yu等[48]發(fā)現(xiàn)意大利工蜂和東方蜜蜂蜂王漿蛋白質組均以蜂王漿主蛋白(MRJPs)為主,意大利工蜂蜂王漿MRJPs表達豐度較高,且專一性表達過氧化物還原酶2540、谷胱甘肽巰基轉移酶S1及蜂王漿主蛋白5(MRJP5),表明意大利工蜂蜂王漿營養(yǎng)價值較高。Liu等[52]利用MALDI-TOF-TOF/MS對15種燕窩樣品進行分析,發(fā)現(xiàn)主要差異蛋白質是酸性幾丁質酶的同源物,為生物標志物的篩選提供了基礎。

肉類加工食品組分多樣且不均一,鑒定較難。Montowska等[49]首次應用常壓解吸附電噴霧電離質譜(DESI-MS)和液萃取表面分析質譜(LESA-MS)鑒定了牛肉、豬肉、馬肉等5種肉類的骨骼肌蛋白質,發(fā)現(xiàn)5種肉類具有各自特有的蛋白質,表明蛋白質組在不同肉類間存在差異。此外,調控蛋白、代謝酶、肌纖維蛋白、血清白蛋白、熱激蛋白27(HSP27)、ATP合成酶等蛋白質可能成為肉類標志物,仍需進一步研究[71]。蛋白質組學在海鮮產品物種鑒定中也得到廣泛應用。利用“鳥槍法”及RP-HPLC結合選擇性串聯(lián)質譜離子監(jiān)測(SMIM)技術,通過檢測物種專一性肽段,可區(qū)分7種小蝦米[5]。Nessen等[7]通過LC-MS/MS進行非靶標數(shù)據(jù)采集及譜庫匹配數(shù)據(jù)分析,成功區(qū)分歐鰈、石斑魚等5種比目魚樣品,并證明此體系具有較強的實用性,可在比目魚親緣關系識別中推廣應用。

蛋白質組學還可應用于過敏原的鑒定或檢測。Pedreschi等[53]將“鳥槍法”和靶標蛋白質組學相結合,利用Nano-ESI-Q-TOF-MS/MS檢測肽段AHVQVVDSNGNR和SPDIYNPQAGSLK,判定花生存在于餅干樣品中,此方法靈敏度高,可檢測的花生含量達微量級別(≥10 μg/g)。利用2-DE及質譜等技術,在燕窩中發(fā)現(xiàn)了一種大小為66 kDa的絲氨酸蛋白酶抑制劑同源體過敏原,為食品安全檢測提供了依據(jù)[72]。

5.2　產地溯源

食品地源分布會影響其品質和營養(yǎng)價值,是食品真?zhèn)舞b別和品質檢測的指標之一。蛋白質標志物可應用于地源識別,具有簡單、快速的優(yōu)點。

Qu等[55]對中國蜜蜂和歐洲蜜蜂的蜂王漿蛋白質組進行了分離、酶解及質譜分析,表明MRJP2和MRJP3在樣品中相對分子質量和等電點存在顯著差異,且中國蜂王漿的多態(tài)性明顯低于歐洲蜂王漿,推動了蜂王漿蛋白質組的研究進展。Won等[56]在韓國本土蜂蜜及歐洲蜂蜜中發(fā)現(xiàn)了兩個一級結構相似、相對分子質量不同的MRJP1蛋白質。將兩種蛋白質的人造標記蛋白質分別與蜂蜜樣品混合并進行SDS-PAGE電泳,根據(jù)條帶數(shù)量可對蜂蜜樣品產地進行區(qū)分。此外,利用蛋白質的指紋圖譜和條形碼也可快速鑒定地理起源。Wang等[73]以16種夏威夷蜂蜜為材料,利用MALDI-TOF-MS獲得蛋白質指紋圖譜,經比對發(fā)現(xiàn)其與數(shù)據(jù)庫中同產區(qū)的蜂蜜間有較好的同源性,與其他產區(qū)的蜂蜜間存在差異,表明指紋圖譜可用于鑒別商業(yè)蜂蜜產品的地理起源。以生長于伊比利亞半島西北海岸和耶爾瑟克的紫貽貝和貽貝為對象進行蛋白質組學研究,發(fā)現(xiàn)兩種樣品間存在37個顯著表達差異蛋白質,利用質譜技術對其中15個差異蛋白質進行鑒定,發(fā)現(xiàn)其與生物的應激、儲存等能力相關,為生態(tài)學和生理學研究提供了依據(jù)[57]。Di等[58]利用2-DE、MALDI-TOF-TOF/MS及生物信息學手段發(fā)現(xiàn)3個不同產地的九孔鮑的足肌蛋白質組間存在表達差異,且差異蛋白質參與了能量的產生、儲存及應激反應;分層聚類分析顯示臺灣鮑魚和越南鮑魚關系相近,與日本鮑魚關系較遠,這與地理分布表現(xiàn)一致?？梢姷鞍踪|組學分析具有較高的精確性和可靠性。Pepe等[59]利用簡易蛋白質組學手段,發(fā)現(xiàn)地中海的金槍魚特異性地具有一種相對分子質量約為70 kDa的蛋白質,可區(qū)分于厄瓜多爾及巴勒莫的金槍魚。

5.3　品質識別

食品品質研究多以果品和農作物為材料,涉及發(fā)育階段、采后貯藏及外源處理等方面。

在生長發(fā)育階段,果實內發(fā)生一系列變化,質地、色澤、香氣等品質逐漸達到成熟標準。Prinsi等[51]以發(fā)育期和成熟的桃果實為研究材料,經串聯(lián)質譜分析,發(fā)現(xiàn)代謝相關酶、乙烯合成酶、脅迫應答相關酶等蛋白質在兩個階段的果實中存在差異,其中1-氨基環(huán)丙烷基羧酸(ACC)氧化酶豐度變化最為明顯,表明乙烯代謝在果實生長發(fā)育階段發(fā)揮重要作用。香氣是評估草莓品質的重要指標,利用蛋白質組學對草莓進行研究,發(fā)現(xiàn)醇?；D移酶、丙酮酸脫羧化酶、醌氧化還原酶等在發(fā)育過程中含量顯著增加,表明其在草莓揮發(fā)性香氣物質合成過程中發(fā)揮了重要作用[60]。與果樹相似,農作物蛋白質組在生長發(fā)育階段也會發(fā)生變化。以綠色期及成熟期的胡椒果實為材料,發(fā)現(xiàn)蛋白質在兩個發(fā)育階段間具有修飾差異,如甲酸脫氫酶、孔蛋白等蛋白質在兩個階段均可被羰基化,而順烏頭酸酶、抗增殖蛋白等只在成熟期發(fā)生羰基化,表明線粒體的羰基化對維持胡椒線粒體功能和成熟過程起著重要作用[61]。

營養(yǎng)品、肉類等食品品質在貯藏過程中發(fā)生的變化引起了廣泛關注。為探究蜂王漿保存的最適溫度,分別將其放置于-20 ℃、4 ℃、常溫各12個月,利用2-DE及多種質譜技術對其蛋白質組進行分析,發(fā)現(xiàn)新鮮蜂王漿樣品及-20 ℃貯藏樣品中的蛋白質數(shù)量多于4 ℃及常溫貯藏的樣品,表明-20 ℃貯藏可較好地維持蜂王漿的營養(yǎng)品質[74]。Zhao等[62]利用質譜技術及免疫印跡法對不同貯藏環(huán)境下的蜂王漿進行分析,發(fā)現(xiàn)MRJP5在常溫貯藏30 d時水解,75 d時完全水解,因此可作為標志物用于蜂王漿的品質評估。肉類食品在貯藏過程中常發(fā)生顏色變化。利用靶向蛋白質組學和生物信息學對貯藏期間黃牛的不同肌肉進行分析,發(fā)現(xiàn)過氧化物酶2及超氧化物歧化酶可作為標志物用于分析肉色穩(wěn)定性,此外,參與最長肌的糖酵解途徑的蛋白質數(shù)量多于腰大肌,表明最長肌比腰大肌的肉色更穩(wěn)定[63]。Yu等[64]利用“鳥槍法”對烘烤后的羊羔背最長肌進行研究,發(fā)現(xiàn)烘烤可導致肌動蛋白、肌球蛋白重鏈、肌漿蛋白的聚集,長時間烘烤會導致蛋白質含量降低,營養(yǎng)成分流失?？梢?蛋白質組學的應用延伸了食品品質相關研究的深度、廣度和精度。

此外,Lerma-García等[65]利用組合肽配體技術(CPLLS)、質譜和指紋圖譜技術對橙汁、蘇打水等飲料進行了品質檢測,正宗的橙汁經串聯(lián)質譜分析得到了1 109個蛋白質,商業(yè)橙汁所含蛋白質數(shù)量明顯減少,而蘇打水中只含有少量蛋白質,此方法可用于評估商業(yè)飲料的品質。

5.4　摻假鑒定

食品產業(yè)中摻假現(xiàn)象頻發(fā),肉類食品是主要領域之一。利用蛋白質組學對標志物進行分析是鑒定肉類食品摻假的重要手段。Surowiec等[68]對生雞肉進行提取、分離和鑒定,發(fā)現(xiàn)血紅蛋白亞基可作為機械回收雞肉的標志物用以摻假檢驗。以商業(yè)肉類產品為實驗材料建立了2 min快速蛋白質提取法,并利用HPLC-MS/MS、MRM及MRM3對具有物種專一性且高度穩(wěn)定的胰蛋白酶標志肽進行快速檢測,判定馬肉或豬肉在牛肉中是否存在,此方法靈敏度高,可檢測到0.24%的摻假含量[69]。肌鈣蛋白I(TnI)可作為動物性肉類食品穩(wěn)定的標記物,Zvereva等[54]利用基于MALDI-TOF的蛋白質組學和酶聯(lián)免疫法對TnI蛋白進行定量,可對哺乳動物的肉類食品進行簡便、高效的檢測。

市場需求導致乳品摻假現(xiàn)象嚴重,真蛋白是乳品質量的重要指標之一,利用SDS-PAGE分離乳品中的蛋白質,對其進行定性和定量分析,建立了真蛋白鑒定圖譜庫用于摻假檢測[70]。Guarino等[75]發(fā)現(xiàn)了綿羊奶的特異性肽段(m/z860),利用此片段可在山羊奶制品中檢測綿羊奶的存在,也可快速定量綿羊奶在奶制品中的比例。蛋白質組學手段的使用加速了摻假檢測的進程,但仍舊存在不足,如檢測范圍局限、覆蓋面小、機制不完全等。

6　小結與展望

基于質譜技術的蛋白質組學具備高穩(wěn)定性、高靈敏度、多重性以及高通量的特點,具有其他方法無可比擬的優(yōu)越性,如可對加工貯藏過程中的特征標記肽段、氨基酸序列的修飾進行監(jiān)控,利用熱穩(wěn)定蛋白對標志物進行篩選,利用PMF技術在序列水平上區(qū)分近緣物種,利用特征肽段進行過敏原檢測等[15,56,62,69]。此外,基于質譜技術的蛋白質組學可以同時檢測多種生物物種,遠好于ELISA的研究效率。因此,基于質譜技術的蛋白質組學日益成為食品真?zhèn)舞b別研究中的核心技術,同其他技術互相補充,成為食品打假的有效工具,有力保障食品安全和消費者利益。

盡管如此,基于蛋白質組學的真?zhèn)舞b別研究也存在某些制約因素,有待進一步研究和突破。首先,為了提高分析結果的靈敏度和可重復性,需建立蛋白質提取和富集的標準方法,包括技術細節(jié)、一定數(shù)量的代表性樣品以及技術重復等,以解決低濃度靶標蛋白質及復雜基質蛋白質提取困難的問題;其次,鑒于分析物和食品種類、濃度的復雜性,蛋白質組學研究的另一限制因素是標準物質的獲得,這將對結果的驗證起到至關重要的作用。此外,蛋白質特征標志物的鑒定將更多地依賴質譜技術的發(fā)展,高分辨質譜技術將有效填補龐大的原始組學數(shù)據(jù)與深層次結果挖掘之間的空白;數(shù)據(jù)非依賴的分析方法(如SWATH技術)能夠在一個循環(huán)中同時定量并分析低豐度蛋白質,將顯著拓寬分析的覆蓋面。最后,新型生物信息學技術的發(fā)展和數(shù)據(jù)庫的共享應用將在食品真?zhèn)舞b別組學數(shù)據(jù)的闡述中起到重要作用。