郭玉琦，劉辰暉，劉桂瓊，姜?jiǎng)灼剑瑒ⅰ≡?/p>

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

目前，在禽類上關(guān)于碳酸酐酶4(CAⅣ)的研究仍較少。生物信息學(xué)是分子生物學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)交叉結(jié)合產(chǎn)生的新學(xué)科，在當(dāng)今的生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，利用生物信息學(xué)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行序列分析,從而推斷并預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)和功能,已成為初步確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的一種捷徑。本研究采用生物信息學(xué)的方法，分析雞CAⅣ蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和功能域，以期為進(jìn)一步研究和探索CAⅣ的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　不同物種CAⅣ氨基酸序列的獲取

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得雞、火雞、鵪鶉、珍珠雞、大雁、綠頭鴨CAⅣ的氨基酸序列，編號(hào)分別為XP_415893.1、XP010720331.1、XP015736158.1、XP021271433.1、XP013053511.1、XP005014440.1。

1.2　生物信息學(xué)分析

用ProtParam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析雞CAⅣ蛋白的氨基酸組成、原子總數(shù)、摩爾消光系數(shù)等參數(shù)。利用ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl1)分析雞CAⅣ的疏水性和親水性。用Mega分析雞、火雞、鵪鶉、珍珠雞、大雁和綠頭鴨CAⅣ的氨基酸序列同源性并構(gòu)建進(jìn)化樹。

用CFSSP工具(Chou & Fasman Secondary Structure Prediction Server，http://www.biogem.org/tool/chou-fasman/)預(yù)測(cè)雞CAⅣ蛋白的α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角，用Signal P4.1 Server軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽，用Protfun 2.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun-2.2/)進(jìn)行功能分類預(yù)測(cè)和分析，用TMHMM Server v.2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域。利用NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，用軟件NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

用DNASTAR預(yù)測(cè)CAⅣ的表面可及性、柔韌性和抗原表位，用zhanglab.cn軟件(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

2　結(jié)果與分析

2.1　雞CAⅣ的理化性質(zhì)分析

雞CAⅣ由316個(gè)氨基酸構(gòu)成，氨基酸種類和含量如表1所示。從表1可以看出，雞CAⅣ的亮氨酸含量最高，其次是絲氨酸，分別為12.3%和8.2%。雞CAⅣ的分子式為C1 653H2 538N424O472S8，總原子數(shù)是5 095個(gè)。不穩(wěn)定系數(shù)為44.29，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)>40時(shí)表明該蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定蛋白，所以雞CAⅣ是不穩(wěn)定蛋白。其疏水值為-0.277，為親水性蛋白。

表1　雞CAⅣ氨基酸構(gòu)成

2.2　不同禽類CAⅣ氨基酸序列同源性比對(duì)

根據(jù)CAⅣ蛋白氨基酸序列構(gòu)建的不同禽類間的進(jìn)化樹見圖1。從圖1可以看出，水禽和陸禽分別歸為一類，它們?cè)谶M(jìn)化上的差異較大，這與動(dòng)物分類學(xué)的分類結(jié)果相符。在陸禽中，雞CAⅣ與鵪鶉相距較遠(yuǎn)，與火雞CAⅣ分子進(jìn)化距離最近，親緣關(guān)系最密切，說(shuō)明兩者CAⅣ的氨基酸序列相似度很高，位于同一個(gè)進(jìn)化枝。

圖1　不同禽類的CAⅣ聚類分析

2.3　雞CAⅣ的親水性和疏水性分析

如圖2所示，雞CAⅣ第7位的纈氨酸疏水性最強(qiáng)，得分為3.111，第182位的谷氨酸親水性最強(qiáng)，得分為-2.456。大部分氨基酸疏水性為負(fù)值，CAⅣ總體平均疏水性為負(fù)值，說(shuō)明整條鏈呈親水性，該蛋白質(zhì)為親水性蛋白，這與其理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖2　雞CAⅣ的親水性和疏水性分析

2.4　雞CAⅣ的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

從圖3可以看出，雞CAⅣ的α螺旋最多，共有221個(gè)，主要集中在氨基酸的第14—18、27—32、41—49、86—89、110—111、113—119、124—128、139—147、152—167、188—193、200—209、218—221、270—280、292—299位；β折疊共有132個(gè)，大多數(shù)在氨基酸的第3—13、19—26、57—72、230—261、300—314位；β轉(zhuǎn)角有43個(gè)，位置較為分散。

圖3　雞CAⅣ的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5　雞CAⅣ的跨膜區(qū)域分析

跨膜結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)與膜相結(jié)合的主要部位，一般由20 個(gè)左右的疏水氨基酸殘基組成，形成一螺旋，它固著于細(xì)胞膜上起“錨定”作用，含有跨膜區(qū)

的蛋白質(zhì)往往與細(xì)胞功能狀態(tài)密切相關(guān)。從圖4可以看出，雞CAⅣ蛋白沒有橫貫細(xì)胞膜，只有一部分處于細(xì)胞膜上，而其余大部分氨基酸位于胞外，因此CAⅣ是膜錨定蛋白。

圖4　雞CAⅣ跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)

2.6　雞CAⅣ的信號(hào)肽區(qū)分析

信號(hào)肽是蛋白質(zhì)的一部分，指新合成的肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的N末端的氨基酸序列，將蛋白質(zhì)導(dǎo)向細(xì)胞的正確位置并使蛋白質(zhì)越過(guò)細(xì)胞器的膜。由圖5可知，雞CAⅣ蛋白分值曲線明顯，剪切位點(diǎn)的C值為0.791，綜合剪切位點(diǎn)的Y值為0.847，標(biāo)記為信號(hào)肽的S值為0.953。具有高C分值同時(shí)又是S分值由高轉(zhuǎn)低的位點(diǎn)最有可能是信號(hào)肽的剪切點(diǎn)，從圖5可以看出，剪切點(diǎn)在第18位和第19位氨基酸之間，S值在剪切位點(diǎn)前高于剪切位點(diǎn)之后，因此，CAⅣ蛋白存在信號(hào)肽，且N端18～19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，意味著該段可能與細(xì)胞發(fā)生相互作用，這也與上述跨膜分析結(jié)果相吻合。

C值表示原始切割位點(diǎn)分值，S值表示信號(hào)肽分值，Y值表示結(jié)合位點(diǎn)分值

2.7　雞CAⅣ的功能預(yù)測(cè)

從表2可以看出，雞CAⅣ組成細(xì)胞膜的可能性最大，概率為13.146，故CAⅣ蛋白可能為細(xì)胞膜的組成成分之一。

表2　雞CAⅣ蛋白功能分類預(yù)測(cè)

2.8　雞CAⅣ的磷酸化位點(diǎn)分析

蛋白質(zhì)的磷酸化是其生物合成后活性調(diào)節(jié)的一種化學(xué)修飾，是控制酶活性的重要步驟，對(duì)蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)意義。由圖6可以看出，雞CAⅣ有22個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，分別在第10、28、35、52、55、83、84、100、138、202、203、212、229、251、256、259、268、285、290、292、293、313位，10個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，分別在第16、44、61、71、94、101、201、231、232、242位，3個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，分別在78、131、223位，說(shuō)明這些位點(diǎn)與酶的活性密切相關(guān)。

圖6　雞CAⅣ磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.9　雞CAⅣ的糖基化位點(diǎn)分析

由圖7可以得出，在第165位的天冬酰胺可能為CAⅣ蛋白糖基化位點(diǎn)。

2.10　雞CAⅣ的三維結(jié)構(gòu)分析

雞CAⅣ三維結(jié)構(gòu)如圖8所示，該蛋白質(zhì)有豐富的折疊和螺旋，這些結(jié)構(gòu)對(duì)其功能有很重要的作用。

圖7　雞CAⅣ糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.11　雞CAⅣ的B細(xì)胞抗原表位分析

由圖9可知，雞CAⅣ有多個(gè)可能抗原位點(diǎn)，主要位于氨基酸的第28—58、77—117、134—147、192—206、219—240、264—279位，第28—58位和77—117位的表面可及性和柔韌性較高。當(dāng)抗原指數(shù)>0，親水性>0，表面可及性>1時(shí)，這些表面可及

性和柔韌性較高的區(qū)域可能形成抗原表位[12-13]，故CAⅣ在第28—58位和77—117位形成抗原表位的可能性較大。

圖8　雞CAⅣ三維結(jié)構(gòu)模擬

圖9　雞CAⅣ抗原表位、親水性、柔韌性、表面可及性預(yù)測(cè)

3　結(jié)論與討論

雞CAⅣ是親水性蛋白，含有明顯的信號(hào)肽，綜合三維結(jié)構(gòu)圖和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，CAⅣ結(jié)構(gòu)復(fù)雜，α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角十分豐富。金屬蛋白酶中與金屬相結(jié)合部位的N端和C端結(jié)構(gòu)域含有豐富的α螺旋和β折疊，α螺旋和β折疊之間的狹縫也與催化底物的識(shí)別密切相關(guān)，嗜熱菌蛋白酶為典型的含鋅金屬蛋白酶，其晶體結(jié)構(gòu)表明N端結(jié)構(gòu)域富含β折疊，C端富含α螺旋，Zn2+位于這2個(gè)區(qū)域的狹縫之間[14]。CAⅣ是含鋅金屬蛋白，其結(jié)構(gòu)域中α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角豐富，也具有這樣的狹縫，可能是其能夠與Zn2+相結(jié)合的條件之一，因此可進(jìn)一步從CAⅣ與Zn2+的結(jié)合方面研究其功能。

哺乳動(dòng)物的CAⅣ通過(guò)磷脂酰肌醇甘油鍵錨定于質(zhì)膜上，在哺乳動(dòng)物的腎臟頂端刷狀緣膜和近端小管基底膜、附睪和輸精管頂膜中均檢測(cè)到CAⅣ的表達(dá)[17]，說(shuō)明CAⅣ可能為膜結(jié)合蛋白。本研究分析了雞CAⅣ的氨基酸序列，也預(yù)測(cè)其為膜結(jié)合蛋白，因此禽類的CAⅣ也很可能是通過(guò)相關(guān)的共價(jià)鍵與細(xì)胞膜結(jié)合。

蛋白質(zhì)的修飾方式有多種，其中磷酸化、糖基化是最普遍、最重要的翻譯后修飾方式[18]，CAⅣ能在細(xì)胞間傳遞信號(hào)、調(diào)控酶活性，離不開蛋白質(zhì)的磷酸化、糖基化。糖基化賦予蛋白質(zhì)傳導(dǎo)信號(hào)的功能，而且某些蛋白質(zhì)只有在該位點(diǎn)發(fā)生糖基化后才能正常折疊，糖基化還可調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)之間的相互作用[19]，影響蛋白質(zhì)的抗原決定簇、穩(wěn)定性、免疫分子的結(jié)構(gòu)和功能[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，雞CAⅣ只有1個(gè)糖基化位點(diǎn)，可能糖基化不是CAⅣ發(fā)揮功能的主要調(diào)控信號(hào)。磷酸化主要通過(guò)三維結(jié)構(gòu)調(diào)控蛋白質(zhì)活性，并在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)CAⅣ有22個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、10個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，其中酪氨酸磷酸化在所有位點(diǎn)中比例最低。當(dāng)細(xì)胞中酪氨酸磷酸化水平低時(shí)，細(xì)胞能較好地對(duì)內(nèi)外刺激做出靈敏反應(yīng)，因此酪氨酸磷酸化位點(diǎn)對(duì)細(xì)胞信號(hào)調(diào)控具有很重要的意義[22]，盡管還需用試驗(yàn)方法確認(rèn)真正起作用的磷酸化位點(diǎn)，但這預(yù)示著后續(xù)可以從酪氨酸磷酸化位點(diǎn)入手研究CAⅣ的功能。

本研究利用生物信息學(xué)方法分析雞CAⅣ的氨基酸序列，研究結(jié)果將有利于對(duì)雞CAⅣ蛋白的功能進(jìn)行深入研究，對(duì)進(jìn)一步研究CAⅣ在母雞生殖道長(zhǎng)期貯存精子中的作用及基因工程疫苗的制備具有重要的意義。