鐘永達 周燕玲 李彥強 劉立盤 劉淑娟 楊愛紅 劉騰云 余發(fā)新

摘 要：研究香樟種子千粒重的變異水平，不僅有助于香樟的遺傳改良，而且有助于香樟產業(yè)的發(fā)展?，F(xiàn)有基于人工計數(shù)的香樟種子千粒重測量方法費時費力，而且容易出現(xiàn)誤差，尤其不適合大樣本的處理。該研究利用掃描儀獲取標準圖形，通過ImageJ軟件自動計數(shù)，稱重后得到千粒重，并與人工計數(shù)法進行了比較；利用該方法對江西境內具有地理代表性和古樟分布廣泛的10個種源種子的千粒重進行了測定，分析了其種源及家系間的變異水平。結果表明：圖像測定法能快速、準確對香樟種子進行計數(shù)，大大提高了千粒重測定的速度；江西局部種源香樟種子千粒重之間的變異主要來自于種源間，群體平均多樣性指數(shù)為1.10，遺傳多樣性水平較低，且千粒重性狀受地理氣候因子影響較小。

關鍵詞：香樟；千粒重；ImageJ軟件；種源；變異

中圖分類號 S792 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）10-0082-04

Application of ImageJ Analysis Software in Measuring 1000-Seed Weight of Cinnamomum

camphora

Zhong Yongda et al.

（The Key Laboratory of Horticultural Plant Genetic and Improvement of Jiangxi，Institute of Biological Resources，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330096，China）

Abstract：The variation research on camphor 1000-seed weight will both contribute to the improvement of genetic breeding and promote the development of camphor industry.However，the measurement of camphor 1000-seed weight based on artificial counting are time-consuming，laborious and prone to error，especially not suitable for large sample processing.In our research，we use the scanner to obtain the standard graphics，counting automatically by ImageJ software，calculating 1000-seed wright after weighing，and compared it with the artificial counting method.Then the camphor 1000-seed weight from Jiangxi provenance and its variation were analyzed.The results showed that scanner with ImageJ software provides a rapid and accurate way to the camphor seeds counting.1000-seed weight variations among camphor trees from Jiangxi mainly come from the provenance，the average diversity index is 1.10 which suggested small genetic variation level among populations，and less affected by climatic factors.

Key words：Cinnamomum camphora；1000-seed weight；ImageJ analysis software；Provenance；Variation

植物種子形態(tài)是植物生活史循環(huán)中的核心特征之一[1]，深刻影響著植物的種子壽命、種子發(fā)芽率、實生苗建成、物種更新能力和種群分布格局等各個方面[2-6]。種子千粒重是林木分類學上的一種重要性狀，在林木遺傳研究上具有重要價值[7]，更是育苗中確定播種量的直接依據之一。傳統(tǒng)的千粒重測定方法是人工計數(shù)后天平稱重，經過換算獲得千粒重，但人工計數(shù)費時費力，不但效率低而且誤差較大。種子自動數(shù)粒儀的出現(xiàn)一定程度上解決了千粒重的自動測定問題[7-9]，但由于種子在穿過檢測區(qū)時會有疊影現(xiàn)象，易造成計數(shù)失誤[9]，而且對于大樣本量而言，即使利用數(shù)粒機仍很費時。因此，如何快速準確進行種子計數(shù)成為千粒重性狀研究的關鍵。

香樟[Cinnamomum camphora （L.）Presl]是我國珍貴材用和經濟樹種，與楠、梓、桐合稱為江南四大名木，為國家二級重點保護野生植物[10]。主要分布在我國長江以南的江西、浙江、福建、臺灣等東南沿海省份，朝鮮、越南、日本等地亦有分布，其他各國有引種栽培[11]。江西全省各地遍布古香樟，現(xiàn)在保存的古樟林有300余處，被譽為“樟樹之鄉(xiāng)”的安福縣400年以上的香樟有8700多株，1000年以上的有200多株[12]。中國開發(fā)利用香樟的歷史悠久，在距今約7000年的河姆渡遺址中就發(fā)現(xiàn)有樟木的使用。香樟種子不僅是香精香料的重要原料，而且還可以制備輕質生物柴油、表面活性劑以及高級洗衣皂、香皂等，果皮還可入藥[3]。因此，開展香樟種子千粒重表型變異的研究，不僅有助于香樟的遺傳改良研究，也有助于其經濟價值的開發(fā)。任華東等通過分析我國香樟47個種源的種子百粒重認為，種子百粒重在產地間存在顯著差異。東南部的江西、福建及浙江南部種源的種子普遍較大，江西井岡山、上饒和遂川三地的香樟種子平均百粒重為18.55g，而云南及廣東種源的種子相對較小。但此次研究中每個種源為10～12棵母樹混合采種，未進行家系研究[13]。李芳等對7個省41個種源的香樟種子的千粒重進行了研究，結果表明樟樹種子千粒重在種源間差異顯著，與經度存極顯著正相關[14]。本實驗室以材用香樟為目標，收集了12個種源，每種源隨機選取3個家系進行了研究，發(fā)現(xiàn)千粒重在種源和家系間的遺傳變異達到極顯著水平[15]。上述香樟種子千粒重的測量大都基于傳統(tǒng)方法進行，費時費力，尤其不適用于大樣本大數(shù)據量的處理。近年來，隨著數(shù)碼照相技術以及計算機圖像處理軟件發(fā)展，為快速簡便進行香樟種子計數(shù)提供了可能。例如美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，USA）開發(fā)的用于科研和臨床中的醫(yī)學影像分析的ImageJ軟件[16]，通過圖像處理和分析，可以輕松實現(xiàn)血細胞和腦皮層細胞的計數(shù)，與人工計數(shù)相比，效率提高10倍以上[17，18]。本研究利用掃描儀結合ImageJ軟件對香樟種子進行計數(shù)，天平稱重，計算得到香樟種子千粒重，所有分析均可以在個人電腦上完成。在此基礎上，選取江西境內具有地理代表性和古樟分布廣泛的10個種源，100株香樟為材料，對其種子千粒重大小變異進行了研究，為香樟等林木種子千粒重的大樣本量測定提供高效技術方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2014年11月底，分別選取江西省科學院院內、江西寧都和安徽安慶3個種源各1棵成年期香樟，采摘紫黑色種子帶回實驗室，清水浸泡2～3d使果皮吸水軟化，用細沙搓揉除凈果皮果肉，洗凈陰干后利用2種方法分別測定千粒重。另外選取江西境內具有地理代表性和古樟分布廣泛的10個種源地，每種源10個家系測量千粒重（表1）。

1.2 圖像測定法

1.2.1 掃描拍照 選取待測香樟種子150～200粒，平鋪于白布上，種子之間隔開一定距離。在白布邊上擺一把有刻度的直尺，作為“標尺”用于在該掃描模式下像素值與距離值的轉換。采用紫光高清拍攝儀Unispro G760（或其他掃描儀）進行掃描，保存文件。

1.2.2 圖像處理 運行ImageJ軟件，Open導入照片。選取直尺上已知距離，打開Analyze/Set Scale，設定參數(shù)。Distance in Pixels為掃描時的分辨率；Known Distance為選取的直尺距離；Pixel Aspect Ratio可理解為放大倍數(shù)，由于掃描時多為100%掃描，此處設置為1.0；Unit of Length為已知距離的長度單位，點擊OK進入下一步驟。打開Image/type/8-bit和Image/Adjust/Threshold，將待測種子彩色圖像轉換成黑白二值圖像，種子自動用黑色進行填充。最后，打開Analyze文件下的Analyze Particles進行計數(shù)，設置Size（mm2）（10-100）和Circularity（0.50～1.00）去除假陽性。點擊OK，輸出結果。該結果可以保存也可直接復制粘貼至Excel表中進行處理。

1.2.3 千粒重換算 用精度為0.001g天平稱重，根據ImageJ軟件測定的粒數(shù)，換算成千粒重。

1.3 人工計數(shù)測定法 測定方法按照國家標準GB 2772-1999進行。從待測定的香樟種子中隨機選取8個重復，每個重復100粒，分別稱重。計算變異系數(shù)，如果變異系數(shù)不超過4，則將各重復換算成千粒重并取平均值。

1.4 數(shù)據分析 對上述測定的數(shù)據進行統(tǒng)計分析。用Excel2010進行調查數(shù)據錄入和整理，并計算各性狀的平均值（X）、標準差（σ）、變異系數(shù)（CV）等；根據平均數(shù)和標準差的結果將每個性狀分為6級，1級，

2 結果與分析

2.1 香樟種子千粒重測定方法的比較 用人工計數(shù)法和圖像測定法分別測量香樟種子的千粒重（表2），結果顯示，2種方法在測定香樟種子千粒重時差異不顯著，而且圖像測定法變異系數(shù)更小，說明圖像測定法是可行的，且更穩(wěn)定。

2.2 江西10個種源香樟種子千粒重表型變異 利用圖像測定法對江西10個種源、100株香樟種子的千粒重進行了測定。結果表明（表3），婺源種源千粒重平均值最小，僅為110.83g；吉安種源最大，為152.68g。千粒重最大的家系來自湖口，為205.62g；千粒重最小的家系來自永修，僅為73.95g。變異系數(shù)介于13.29%～25.18%，最大的是湖口種源，最小的是安義種源。10個群體的遺傳多樣性指數(shù)介于0.80～1.50，其中最高的為湖口群體，最低的是全南群體，平均遺傳多樣性指數(shù)為1.10，表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性水平。

雙因素方差分析結果表明（表4），千粒重性狀在各種源間的差異達到極顯著水平，家系間差異不顯著，說明香樟種子千粒重的差異主要存在于種源間。

2.3 聚類分析 對香樟各種源的種子大小進行聚類分析，其結果見圖1。從圖1可以看出，10個種源可以分為2大類群，安福、瑞昌、全南、靖安、永修和婺源聚為一大類；吉安、湖口、遂川和安義聚為一類。聚類結果與地理種源沒有直接關系，說明香樟種子千粒重與經緯度沒有直接相關性且可能是由微效多基因控制。

2.4 江西10個種源香樟種子千粒重對地理氣候因子的響應 通過相關性分析結果表明（表5），香樟種子千粒重與經度、緯度、海拔呈負相關，與年均氣溫正相關，但都未達到顯著水平，說明江西省內種源香樟種子千粒重對地理氣候因子的響應較小。

3 結論與討論

樹木種子大小影響著樹木的生物學和生態(tài)學等一系列特征[1]。目前，學者們對林木種子的千粒重變異情況進行了廣泛研究，但大多采用人工計數(shù)的方法進行測定[13-15，20-23]。ImageJ軟件已被廣泛應用于醫(yī)學細胞的自動計數(shù)中，并展現(xiàn)出相當?shù)臏蚀_性和簡便性[24]。本研究利用掃描儀或其他拍照工具獲得標準圖像，利用ImageJ軟件的分析功能可以實現(xiàn)種子粒數(shù)的自動測定。與人工計數(shù)測定法相比，本方法在保證準確性的前提下（表2），大大縮短了計數(shù)時間，并減少了人工計數(shù)可能帶來的誤差。根據實驗對比，用圖像處理法測量100份每份100～200粒香樟種子千粒重，1個人6h內可以完成，如果用人工計數(shù)，大概需要18h，效率提高3倍以上。不僅如此，通過ImageJ軟件分析，還可以對種子大小性狀進行測量，進行種子大小的全面分析。所有得到的數(shù)據均將自動保存在Excel表中，減少了數(shù)據錄入時間。

長期的地理隔離造成的基因漂移，可能導致同一個樹種的不同地理種源在種內出現(xiàn)變異[14]。香樟是一個古老的樹種，早在石炭紀已有香樟植物的化石。在長期的自然演替和進化過程中，形成了江西不同的地理種源間種子千粒重的差異。本研究利用圖像測定法，對江西省境內具有地理代表性且古香樟分布廣泛的10個種源、100個家系的種子千粒重進行了測定和表型變異分析。結果表明，江西10個種源香樟種子千粒重之間的變異主要來自于種源間，家系間差異不顯著（表4）。本實驗室前期利用材用香樟群體為材料也得到了相似的結論[15]，與李芳[14]、任華東[13]等人的研究結果相似，說明在相似的地理氣候條件下，遺傳是決定種子重量的決定因素。然而，本研究中種源內家系間的差異未達到顯著水平，且群體內的遺傳多樣性水平較低（表3，表4），暗示了江西省內各個種源在長期的地理隔離過程中，形成了遺傳的有效隔離。相關研究表明，種子千粒重的地理梯度變異是一個受生境水分、溫度、海拔等多因素控制的復雜過程，是植物對不同生境下“脅迫耐受假說”和“資源限制假說”的權衡選擇的結果[25]。李芳和任華東等研究均認為，香樟種子的千粒重與經度呈顯著正相關，隨著經度的增加，種子越重，即東部種源種子千粒重往往較大[13，14]。而其他一些研究結果認為，植物種子的重量與緯度呈顯著負相關，即緯度越高，種子越輕[26]。然而，本研究中相關性分析表明，江西省內種源種子千粒重與經緯度、海拔、年均氣溫等相關性均不顯著（表5），聚類分析結果也表明種子千粒重與經緯度沒有直接相關性（圖1），這可能是本研究僅針對江西省內局部種源，經度大都在東經114°～116°，取樣范圍比較集中所致。香樟種子千粒重的地理梯度變異情況仍需進一步深入研究。

本研究通過掃描儀獲取標準圖像，利用ImageJ軟件自動輸出種子粒數(shù)，無需編程就可實現(xiàn)大量樣品的處理。將圖像測定法應用于江西省內種源大樣本量香樟種子千粒重的變異研究，驗證了該方法的有效性。相比傳統(tǒng)的人工計數(shù)法，該方法快速簡便，且穩(wěn)定有效，有利于大樣本量香樟種子千粒重的研究。

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（責編：張宏民）