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        靈芝—銀杏雙向固體發(fā)酵抗氧化性優(yōu)化及活性物質(zhì)的研究

        2018-07-09 01:19:34辛燕花楊丹劉陽(yáng)白曉靜張鐵丹
        安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) 2018年10期
        關(guān)鍵詞:抗氧化性靈芝銀杏

        辛燕花 楊丹 劉陽(yáng) 白曉靜 張鐵丹

        摘 要:以靈芝菌株作為出發(fā)菌株,以銀杏葉作為基質(zhì),通過(guò)雙向發(fā)酵工程技術(shù),對(duì)靈芝菌株的抗氧化性及活性物質(zhì)進(jìn)行了研究。通過(guò)測(cè)定超氧自由基清除能力、還原能力、羥基自由基清除能力對(duì)新型菌株的抗氧化性進(jìn)行了評(píng)價(jià),在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了靈芝—銀杏雙向固體發(fā)酵的最佳條件結(jié)果表明:在銀杏葉添加量為5g/袋(300g),培養(yǎng)料含水率為70%、滅菌時(shí)間90min的條件下,靈芝菌株的還原力達(dá)到0.374;活性物質(zhì)多糖含量為51.60 mg/g,三萜含量為14.42 mg/g,總黃酮質(zhì)含量為5.76 mg/g,分別是對(duì)照的1.98倍、2.02和2.35倍。

        關(guān)鍵詞:靈芝;銀杏;雙向發(fā)酵;抗氧化性;活性物質(zhì)

        中圖分類號(hào) TQ61;TQ929 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731(2018)10-0014-05

        Study on the Antioxidative Optimization and Active Substances of Ganoderma lucidum and Ginkgo biloba Bi-directional Solid Fermentation

        Xin Yanhua1 et al.

        (1 Department of Biology,Xinzhou Teachers University,Xinzhou 034000,China)

        Abstract:Using bi-directional solid fermentation technology,Ginkgo biloba for medicinal matrix and Ganoderma lucidum as fermentation strain,the bi-directional solid fermentation conditions were optimized with the antioxidant activity (reducing power,superoxide radical scavenging and OH- scavenging) as the main index through single factor and orthogonal test,and the active materials were measured.Result showed that the optimum fermentation culture conditions were:the amount of Ginkgo biloba 5g/bag (300g),moisture content in medium was 70%,sterilizing time was 90min.In the condition,the antioxidant activity of fermentation medium was the highest,reducing power was 0.374;and the yield of polysaccharide,triterpene compounds and total flavonoids 51.60mg/g,14.42 mg/g and 5.76 mg/g,compared with the control,these active materials were up to 1.98,2.02,and 2.35 times respectively.

        Key words:Ganoderma lucidum;Ginkgo biloba;Bi-directional fermentation;Antioxidant activity;Active material

        “藥用真菌雙向發(fā)酵工程”是指以藥用真菌為發(fā)酵菌株,以具有活性成分的各種中藥材作為基質(zhì),該基質(zhì)既提供真菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng),又因真菌的分解(合成)而產(chǎn)生新的成分,從而使整個(gè)發(fā)酵作用具有雙向性[1]。雙向發(fā)酵的產(chǎn)物,同時(shí)具備藥用真菌和中藥材的成分和功效,還可能產(chǎn)生新的性味和功效,通過(guò)不同真菌與不同中藥材交叉、復(fù)合組合可構(gòu)成大量的組合,產(chǎn)生種類繁多的發(fā)酵產(chǎn)物,該發(fā)酵產(chǎn)物可作為創(chuàng)新中藥材的材料[2]。

        靈芝(Ganoderma lucidum)是多孔菌科真菌,靈芝的子實(shí)體,俗稱靈芝草,仙草、瑞草[3],是一種食藥兼用真菌,具有較強(qiáng)的抗氧化能力?,F(xiàn)代藥理與臨床研究表明,靈芝具有多種功效,包括保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗組織胺釋放、抗衰老、抑制HIV-1蛋白酶活性、抑制血管緊張素以及調(diào)節(jié)血糖等[4-5]。銀杏(Ginkgo Liloba L.)是銀杏科銀杏屬植物,俗稱白果樹(shù),是目前應(yīng)用最為廣泛的中藥材之一。大量研究證實(shí)銀杏葉中含有黃酮和二萜內(nèi)酯等化學(xué)成分,具有抗氧化、抗衰老等作用[6]。近年來(lái),靈芝雙向發(fā)酵技術(shù)的研究進(jìn)展迅速,魏龍、楊海龍、王林等[7,8]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)靈芝過(guò)程中,添加適量的中藥材,如黃芪、玄參、當(dāng)歸、黨參粉末或其水提取物等,可以有效提高靈芝的抗氧化性。本課題組通過(guò)在液體培養(yǎng)基中添加銀杏葉粉末發(fā)酵靈芝后,發(fā)現(xiàn)靈芝菌絲體中的抗氧化性及活性物質(zhì)明顯提高[9]。因此,本研究繼續(xù)探索以銀杏葉為培養(yǎng)基質(zhì)在固體發(fā)酵條件下靈芝子實(shí)體的抗氧化性及活性物質(zhì)成分,為藥用真菌和中藥材的雙向固體發(fā)酵提供一定的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌株與試劑 靈芝購(gòu)于福建食用菌研究所;銀杏葉采摘于忻州師范學(xué)院;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品:上海阿拉丁生化試劑有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:上海阿拉丁生化試劑有限公司;其他試劑均為分析純。

        1.1.2 儀器與設(shè)備 立式雙層智能精密型搖床(BSD-YX3200):上海助泰有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-8):力辰科技有限公司;離心機(jī)(TG-16B):昊天儀器有限公司;臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)(Scientz-10N):寧波新芝儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-30KBS):上海申安有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(721-100):上海菁華儀器有限公司。

        1.2 最適發(fā)酵單因素試驗(yàn)

        1.2.1 樣品處理 將新鮮的銀杏葉,放置在真空冷凍干燥機(jī)中,冷阱溫度-40℃、真空度20Pa、加熱板溫度10℃。冷凍干燥8h,質(zhì)量不變,粉碎備用。

        1.2.2 銀杏葉影響因子 以基礎(chǔ)培養(yǎng)料(棉籽殼98%,蔗糖1%,石膏1%)裝袋,每袋含量300g,分別加入銀杏葉5、10、15、20、25g,各3組平行實(shí)驗(yàn),28℃避光培養(yǎng),待靈芝子實(shí)體成熟時(shí),測(cè)定子實(shí)體的抗氧化性。

        1.2.3 基質(zhì)含水率影響因子 以確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)銀杏葉的量為基礎(chǔ)配料,設(shè)置培養(yǎng)基的含水率為55%、60%、65%、70%、75%五個(gè)梯度,121℃,滅菌2h,28℃避光培養(yǎng),各3組平行實(shí)驗(yàn),待靈芝子實(shí)體成熟時(shí),測(cè)定子實(shí)體的抗氧化性。

        1.2.4 基質(zhì)滅菌時(shí)間影響因子 以確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)銀杏葉的量為基礎(chǔ)配料,以最適含水量浸泡過(guò)夜,拌勻裝袋在121℃下分別滅菌30、60、90、120min,各3組平行實(shí)驗(yàn),28℃避光培養(yǎng),待靈芝子實(shí)體成熟時(shí),測(cè)定子實(shí)體的抗氧化性。

        1.3 最適發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交實(shí)驗(yàn)表L9(33)對(duì)發(fā)酵銀杏量、基質(zhì)含水量、基質(zhì)滅菌時(shí)間進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)(表1),每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理進(jìn)行3次重復(fù)。正交實(shí)驗(yàn)所得發(fā)酵產(chǎn)物以其還原力為指標(biāo),進(jìn)行極差和方差分析,確定最佳發(fā)酵條件。

        1.4 抗氧化活性的測(cè)定 能力測(cè)定參照文獻(xiàn)進(jìn)行[10]。

        1.5 活性物質(zhì)的測(cè)定 多糖的提取參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行,以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.3277x-0.0052,R2=0.9991。

        總?cè)频奶崛⒖嘉墨I(xiàn)[12]進(jìn)行,以熊果酸標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:y= 5.894x-0.0105,R2=0.9992。

        總黃酮的提取參照文獻(xiàn)進(jìn)行[13],以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=1.7492x+0.0102,R2=0.9997。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS Statistics 21軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素條件確定

        2.1.1 接種銀杏葉因素 通過(guò)在培養(yǎng)料中添加不同含量的銀杏葉基質(zhì),考察靈芝子實(shí)體的抗氧化性能力,結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出,銀杏葉基質(zhì)含量對(duì)靈芝子實(shí)體的抗氧化性有一定的影響,添加銀杏葉的含量為10g/袋時(shí),發(fā)酵后靈芝菌絲體的抗氧化性最高,為最佳添加質(zhì)量濃度。

        2.1.2 培養(yǎng)料含水量因素 通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)料中不同含水率對(duì)發(fā)酵后靈芝子實(shí)體的抗氧化性能力,發(fā)現(xiàn)含水率對(duì)靈芝子實(shí)體的抗氧化性能力有一定的影響。在靈芝子實(shí)體形成過(guò)程發(fā)現(xiàn),含水率在65%、70%、75%這3個(gè)梯度之間時(shí),菌絲滿袋形成子實(shí)體的速度要明顯高于含水率為55%和60%。從圖2可以看出,隨著培養(yǎng)料含水率的不斷增加,靈芝菌株的還原力、超氧自由基清除能力和羥自由基清除能力都表現(xiàn)出先升高后下降又升高的現(xiàn)象。在含水率為65%時(shí),各項(xiàng)指標(biāo)都達(dá)到最大值,選取含水率為65%時(shí)作為發(fā)酵培養(yǎng)的最適含水量。

        2.1.3 最適滅菌時(shí)間因素 對(duì)靈芝銀杏雙向固體發(fā)酵的最適滅菌時(shí)間進(jìn)行分析,結(jié)果如圖3所示。滅菌時(shí)間也是影響靈芝子實(shí)體抗氧化能力的一個(gè)重要因素。滅菌時(shí)間為90min時(shí),發(fā)酵后靈芝菌絲體的抗氧化性最高,為最佳添滅菌時(shí)間。

        2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 基于單因素所得的最佳條件,采用正交表L9(34)安排正交試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如表2。

        從表2可以看出,對(duì)靈芝子實(shí)體還原力影響最大的是滅菌時(shí)間,其次含水率,影響最小的是銀杏葉添加量,還原力最大的最優(yōu)組合是A1B1C2。進(jìn)一步通過(guò)方差分析驗(yàn)證各因素對(duì)靈芝子實(shí)體還原能力的影響程度,結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出,對(duì)靈芝子實(shí)體還原力影響顯著的是含水率和滅菌時(shí)間

        由于正交試驗(yàn)中得出的最佳發(fā)酵條件(A3B1C2)和在極差分析結(jié)果中得出的最優(yōu)組合(A1B1C2)不一致,通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。即將含水率60%,銀杏葉添加量5g、滅菌時(shí)間90min的條件下進(jìn)行靈芝發(fā)酵培養(yǎng),對(duì)所得子實(shí)體進(jìn)行還原力的測(cè)定,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,測(cè)的靈芝子實(shí)體的還原力為0.346,低于在正交組合的最大值。因此,選取正交組合中的A3B1C2為發(fā)酵的最優(yōu)組合,含水率為70%,銀杏葉添加量為5g,滅菌時(shí)間為90min。

        2.3 靈芝菌株的活性成分分析 進(jìn)一步探討引起發(fā)酵體系抗氧化活性變化的原因,在最優(yōu)條件下,對(duì)發(fā)酵后靈芝子實(shí)體的部分活性成分多糖,總?cè)坪忘S酮進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表4所示。

        從表4可以看出,與靈芝原種相比,以銀杏葉為基質(zhì)的雙向發(fā)酵后靈芝菌株中的多糖、三萜化合物及黃酮含量明顯增加,多糖的含量為51.60mg/g,三萜化合物的含量為4.42mg/g,黃酮的含量為5.76mg/g;分別是對(duì)照的1.98倍、2.02倍和2.35倍。

        3 討論

        本研究通過(guò)一定的優(yōu)化,以銀杏葉為培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)酵后的靈芝子實(shí)體的抗氧化性及部分具有抗氧化性的活性物質(zhì)含量明顯提高。

        研究報(bào)道,在靈芝發(fā)酵過(guò)程中,培養(yǎng)料的組成對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物成分的變化有顯著的影響[14]。在本研究中,以銀杏葉的添加量作為首要的考察因素。結(jié)果表明,高濃度的銀杏葉添加量會(huì)抑制靈芝菌絲體的生長(zhǎng),這與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果一致[15],魏龍等研究也表明中藥材中的某些成分會(huì)抑制真菌的生長(zhǎng)發(fā)酵[7]。培養(yǎng)基含水率是影響靈芝生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要因素,如果培養(yǎng)基含水率過(guò)少,則會(huì)導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)延緩,產(chǎn)量和品質(zhì)會(huì)大大降低;而培養(yǎng)基含水率過(guò)多,則培養(yǎng)基在高壓滅菌過(guò)程中,降低了培養(yǎng)基內(nèi)部的透氣性,使其缺少氧氣,不利于菌絲進(jìn)一步生長(zhǎng)[16]。在本研究中,培養(yǎng)基含水率過(guò)低和過(guò)高培養(yǎng)下的靈芝菌株的抗氧化性都比較低。培養(yǎng)料滅菌是食用菌栽培中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,培養(yǎng)料滅菌必須徹底,否則會(huì)造成雜菌嚴(yán)重污染而影響菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育,甚至不能出菇;而滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng),致使培養(yǎng)基中某些成分和中間代謝產(chǎn)物發(fā)生變化,從而抑制微生物的新陳代謝作用[17]。在滅菌時(shí)間90min時(shí),菌質(zhì)的抗氧化性能最大,推測(cè)原因可能是培養(yǎng)料滅菌時(shí)間較短,雜菌沒(méi)有徹底殺死,影響了靈芝菌株的生長(zhǎng)發(fā)育,而長(zhǎng)時(shí)間的高壓滅菌,導(dǎo)致培養(yǎng)基中的成分和銀杏葉的有效成分遭到了破壞,抗氧化性能下降。

        靈芝作為抗氧化性較強(qiáng)的大型真菌,多糖和三萜含量較高,銀杏葉中抗氧化物質(zhì)黃酮的含量較高,為了考察發(fā)酵后的靈芝菌株中的活性物質(zhì)是否來(lái)源于二者的雙向發(fā)酵,在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)一步測(cè)定發(fā)酵后的靈芝菌株中的多糖、三萜、黃酮。經(jīng)過(guò)銀杏葉為基質(zhì)培養(yǎng)發(fā)酵的靈芝子實(shí)體中多糖、三萜、黃酮的含量明顯增加。探討引起靈芝子實(shí)體中抗氧化性活性物質(zhì)變化的原因,可能是多種因素的綜合作用。首先,在銀杏葉作為基質(zhì)發(fā)酵靈芝的過(guò)程中,銀杏葉中的某些物質(zhì)促進(jìn)靈芝中多糖、三萜等抗氧化活性物質(zhì)的產(chǎn)生;其次,靈芝在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量的酶分解銀杏組織及細(xì)胞壁中的纖維素和木質(zhì)素等大分子物質(zhì),從而有利于銀杏多糖、黃酮等物質(zhì)的析出和游離;另外,在發(fā)酵過(guò)程中,微生物的生物轉(zhuǎn)化作用可能將其他成分轉(zhuǎn)化為多糖黃酮類物質(zhì)。

        參考文獻(xiàn)

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        (責(zé)編:王慧晴)

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