李榮，全亦周，夏偉梁上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院(上海，200030)

前列腺癌是男性常見(jiàn)的惡性腫瘤，在北美等發(fā)達(dá)國(guó)家前列腺癌發(fā)病率和死亡率占據(jù)男性惡性腫瘤的第一位和第三位[1]。隨著我國(guó)國(guó)民生活水準(zhǔn)的提高、 飲食變化及壽命的延長(zhǎng)，前列腺癌新增患者每年以6～7萬(wàn)人次的速度增加[2]。隨著病程惡化，部分病人發(fā)生前列腺癌轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞依賴于活躍的基因網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)對(duì)稱分裂使其具有自我更新能力，也可通過(guò)隨機(jī)事件或者響應(yīng)環(huán)境信號(hào)進(jìn)行不對(duì)稱分裂或分化[3]； 有科研人員認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)程序，可維持腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)程的惡化[4]，提出腫瘤干細(xì)胞可能是腫瘤的源頭細(xì)胞，也是治療腫瘤的重要靶點(diǎn)。因此針對(duì)前列腺癌的研究，很多研究人員將關(guān)注點(diǎn)放在前列腺癌干細(xì)胞上，以期更好地探索前列腺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，最終為患者提供更好的治療效果[5]。

目前，報(bào)道較多的腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物為CD44，OCT4，NANOG等[6]，在前列腺癌干細(xì)胞研究中，Gong等[7]提出NANOG可能有助于前列腺癌干細(xì)胞維持自我更新，可作為未來(lái)前列腺癌干細(xì)胞分離和鑒定的一個(gè)標(biāo)志； Jeter等[8]提出NANOG可促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞特性，促進(jìn)前列腺癌對(duì)雄激素缺乏的抵抗力。此外，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)一種依賴于 NAD+的組蛋白去乙?；福琒IRT3，可在前列腺癌中抑制PI3K-Akt通路引起c-MYC的不穩(wěn)定，抑制前列腺癌細(xì)胞增殖[9]。

因此，本研究在前列腺癌細(xì)胞系和前列腺癌病人樣本中檢測(cè)SIRT3與NANOG表達(dá)水平，挖掘二者相關(guān)性，以期SIRT3能夠?yàn)槲磥?lái)前列腺癌干細(xì)胞的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人源前列腺癌細(xì)胞系LNCap，22RV1，C42B，DU145和PC3由ATCC中心提供。前列腺癌病人樣本石蠟切片由蕭山第一人民醫(yī)院提供。

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，驢血清和二抗購(gòu)于美國(guó)Jackson Lab公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和蛋白酶抑制劑購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，SIRT3和NANOG抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司，H2O2購(gòu)于上海生工生物技術(shù)有限公司，DAPI和抗熒光淬滅封片劑購(gòu)于中國(guó)碧云天公司，RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，NC膜購(gòu)于美國(guó)GE公司。

1.2 方法

1.2.1基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘

本研究涉及的基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)主要為Oncomine和cBioportal，根據(jù)腫瘤種類搜索分析相關(guān)基因表達(dá)情況和相關(guān)性。

1.2.2免疫熒光染色

前列腺癌病理石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯和梯度酒精脫蠟后，在濕盒里滴加3 % H2O2于組織上避光孵育10 min，PBS清洗三次。使用10 %驢血清封閉1 h后，一抗4 °C孵育過(guò)夜； 第二天回收一抗，室溫孵育熒光二抗和DAPI 1 h。在方形載玻片上滴加適量抗熒光淬滅劑，蓋上圓玻片，用透明指甲油封片，室溫下晾干，拍照分析。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)

將人源前列腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)在含10 %胎牛血清和1 %青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基里，將細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在含37 °C，5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱里。

1.2.4免疫蛋白印跡(Western Blot)

RIPA裂解細(xì)胞后收集細(xì)胞蛋白樣本，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白，加入適量6 × Loading Buffer，95 °C熱激變性5 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。電泳分離后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至0.45 μm NC膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜放入含有5 %脫脂奶粉的1 × TBST溶液中封閉1 h。加入相應(yīng)一抗，搖床4 °C孵育過(guò)夜，第二天回收一抗，用1 × TBST溶液清洗三次； 加入對(duì)應(yīng)二抗，搖床室溫孵育1 h，用1 × TBST溶液清洗三次。配置顯影液將其加到NC膜上，并在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯色，再進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

使用Image J進(jìn)行免疫蛋白印跡定量分析，使用Graphpad Prism和SigmaPlot進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組內(nèi)比較時(shí)使用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析使用回歸分析，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001。

2 結(jié)果

(1)通過(guò)挖掘腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine檢測(cè)前列腺癌病人樣本， 本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)相比于正常前列腺組織， SIRT3在前列腺癌病人樣本中表達(dá)較低[9]； 本研究使用同樣方法檢測(cè)NANOG在前列腺癌病人樣本中表達(dá)情況。如圖1， 本研究發(fā)現(xiàn)相比于正常前列腺組織， NANOG在前列腺癌病人樣本中mRNA水平較高， 其中正常前列腺人群樣本為29， 前列腺癌病人樣本為131。此外， 我們調(diào)研文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Miyazawa等[10]在前列腺癌病人樣本中通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)NANOG表達(dá)情況：發(fā)現(xiàn)相比于正常組織， NANOG在前列腺癌病人樣本中表達(dá)較高， 見(jiàn)圖1。

(2)本研究繼續(xù)挖掘腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)cBioportal檢測(cè)SIRT3和NANOG在前列腺癌病人樣本中表達(dá)情況， 如圖2所示。

二者在mRNA水平上表達(dá)呈一定程度負(fù)相關(guān)關(guān)系， 經(jīng)回歸分析R值為-0.47。此外， 通過(guò)免疫熒光染色在前列腺癌病理石蠟切片中檢測(cè)SIRT3和NANOG表達(dá)， 如圖3所示。我們發(fā)現(xiàn)在正常前列腺組織中SIRT3表達(dá)較高， 而在前列腺癌病人組織中NANOG表達(dá)較高。進(jìn)一步揭示SIRT3與NANOG表達(dá)在前列腺癌組織中呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中NANOG在正常前列腺和前列腺癌病人樣本中mRNA表達(dá)水平(Taylor Prostate Statistics，n=160，**P<0.01，Student's t-test)。Fig.1 The mRNA level of NANOG in prostate gland and prostate carcinoma samples selected from oncomine (Taylor Prostate Statistics, n=160, **P<0.01, Student's t-test).

圖2 SIRT3和NANOG在前列腺癌病人樣本中mRNA表達(dá)水平相關(guān)性(Neuroendocrine Prostate Cancer (Trento/Cornell/Broad 2016)，cBioportal數(shù)據(jù)庫(kù)，n=45，Regression Analysis)

圖3 SIRT3和NANOG在前列腺組織以及前列腺癌樣本中的表達(dá)情況(Bar=50 μm)

(3)更深入地研究，在前列腺癌細(xì)胞系LNCap，22RV1，DU145，PC3和C42B中通過(guò)Western Blot檢測(cè)SIRT3和NANOG本底蛋白表達(dá)水平，如圖4所示。經(jīng)過(guò)線性回歸分析，SIRT3和NANOG本底蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且R2為0.357 5，如圖4(b)所示，經(jīng)線性回歸分析，二者具有一定相關(guān)性。

圖4 SIRT3和NANOG在前列腺癌細(xì)胞系中蛋白表達(dá)情況Fig.4 The protein level of SIRT3 and NANOGin prostate cancer cells

3 討論

將腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行體外移植可產(chǎn)生相同的癌組織， 因此腫瘤干細(xì)胞是形成不同分化程度的腫瘤細(xì)胞和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的根源， 腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為， 腫瘤組織是不均一的， 腫瘤組織中只有很少一部分腫瘤細(xì)胞具有治瘤的潛能[11]。而前列腺癌臨床特征為前列腺組織不均一、 激素治療可殺死大部分癌細(xì)胞而總有一小部分癌細(xì)胞存活下來(lái)， 隨著時(shí)間推移， 這些存活下來(lái)的細(xì)胞可長(zhǎng)出新的具有耐藥性和高轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細(xì)胞[12]。因此前列腺癌干細(xì)胞為臨床上經(jīng)雄激素治療無(wú)效后, 產(chǎn)生的雄激素非依賴性和前列腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象提供了合理的解釋， 針對(duì)前列腺癌干細(xì)胞的研究和治療也顯得尤為重要。

前列腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物是存在于干細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的抗原小分子。近年來(lái)， 科研人員提出腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物NANOG在前列腺癌進(jìn)程中扮演重要角色。Miyazawa等在前列腺癌病人樣本中通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)四種腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物——NANOG， OCT4， CD133和NESTIN， 發(fā)現(xiàn)NANOG表達(dá)最高， 并且隨著Gleason分級(jí)越高NANOG表達(dá)越高[10]； Jeter等[13]提出NANOG可通過(guò)動(dòng)態(tài)抑制AR/FOXA1信號(hào)軸重組前列腺癌細(xì)胞去勢(shì)抵抗。此外， 結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)SIRT3破壞癌基因c-MYC穩(wěn)定性抑制前列腺癌細(xì)胞增殖， 其中c-MYC已被報(bào)道參與調(diào)控前列腺癌干細(xì)胞進(jìn)程：Li等[14]提出SREBP-2與c-MYC相互作用激活c-MYC轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞干性維持， 進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移； Yun等[15]提出DAB2IP可抑制c-kit-PI3K-Akt-mTOR通路上調(diào)c-MYC蛋白表達(dá)， 進(jìn)而激活ZEB1調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞干性特性； Vyas等[16]提出c-MYC參與萊菔硫烷抑制前列腺癌干細(xì)胞特性維持的過(guò)程。而作為調(diào)控干細(xì)胞的重要基因， c-MYC和NANOG二者之間亦有諸多報(bào)道：Marzi等[17]提出NANOG， KLF4和 c-MYC轉(zhuǎn)錄回路參與肝癌細(xì)胞重編程進(jìn)程； c-MYC和NANOG都可參與誘導(dǎo)形成多功能干細(xì)胞[18-19]?；诖耍?本研究通過(guò)挖掘基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)和應(yīng)用免疫熒光染色和免疫蛋白印跡等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)分析前列腺癌病人樣本和前列腺癌細(xì)胞系里SIRT3與NANOG表達(dá)情況， 分析揭示二者表達(dá)負(fù)相關(guān)的關(guān)系， 提示SIRT3可能參與前列腺癌干細(xì)胞干性維持、 體內(nèi)成瘤等眾多進(jìn)程， 為未來(lái)臨床治療前列腺癌提供新的思路。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中需進(jìn)行深入的功能研究， 探索SIRT3在前列腺癌干細(xì)胞臨床應(yīng)用中的價(jià)值。

[1] Siegel R L, Miller K D, Jemal A. Cancer Statistics,2017[J]. CA Cancer J Clin,2017,67(1):7-30.

[2] Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer statistics in China,2015[J]. CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-32.

[3] Mateo F, Fernandez P L, Thomson T M. Stem cells in prostate cancer [J]. Arch Esp Urol,2013,66(5):475-86.

[4] Jaworska D, Krol W, Szliszka E. Prostate cancer stem cells: research advances [J]. Int J Mol Sci,2015,16(11):27433-27449.

[5] Feitelson M A, Arzumanyan A, Kulathinal R J, et al. Sustained proliferation in cancer: Mechanisms and novel therapeutic targets [J]. Semin Cancer Biol,2015,35(Suppl):S25-S54.

[6] Vlashi E, Pajonk F. Cancer stem cells, cancer cell plasticity and radiation therapy [J]. Semin Cancer Biol,2015,31:28-35.

[7] Gong C, Liao H, Guo F J, et al. Implication of expression of Nanog in prostate cancer cells and their stem cells [J]. J Huazhong U Sci Med,2012,32(2):242-246.

[8] Jeter C R, Liu B, Liu X, et al. NANOG promotes cancer stem cell characteristics and prostate cancer resistance to androgen deprivation [J]. Oncogene,2011,30(36):3833-3845.

[9] Quan Y Z, Wang N T, Chen Q Q, et al. SIRT3inhibits prostate cancer by destabilizing oncoprotein c-MYC through regulation of the PI3K/Akt pathway [J]. Oncotarget,2015,6(28):26494-26507.

[10] Miyazawa K, Tanaka T, Nakai D, et al. Immunohistochemical expression of four different stem cell markers in prostate cancer: High expression of NANOG in conjunction with hypoxia-inducible factor-1alpha expression is involved in prostate epithelial malignancy [J]. Oncol Lett,2014,8(3):985-992.

[11] Wang T, Shigdar S, Gantier M P, et al. Cancer stem cell targeted therapy: progress amid controversies [J]. Oncotarget,2015,6(42):44191-206.

[12] Wang Z A, Shen M M. Revisiting the concept of cancer stem cells in prostate cancer [J]. Oncogene,2011,30(11):1261-71.

[13] Jeter C R, Liu B, Lu Y, et al. NANOG reprograms prostate cancer cells to castration resistance via dynamically repressing and engaging the AR/FOXA1signaling axis [J]. Cell Discov,2016,2:16041.

[14] Li X, Wu J B, Li Q, et al. SREBP-2promotes stem cell-like properties and metastasis by transcriptional activation of c-Myc in prostate cancer [J]. Oncotarget,2016,7(11):12869-84.

[15] Yun E J, Baek S T, Xie D, et al. DAB2IP regulates cancer stem cell phenotypes through modulating stem cell factor receptor and ZEB1[J]. Oncogene,2015,34(21):2741-2752.

[16] Vyas A R, Moura M B, Hahm E R, et al. Sulforaphane Inhibits c-Myc-Mediated Prostate Cancer Stem-Like Traits [J]. J Cell Biochem,2016,117(11):2482-2495.

[17] Marzi I, Cipolleschi M G, D’Amico M, et al. The involvement of a Nanog, Klf4and c-Myc transcriptional circuitry in the intertwining between neoplastic progression and reprogramming [J]. Cell Cycle,2013,12(2):353-364.

[18] Takahashi K，Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors [J]. Cell,2006,126(4):663-676.

[19] Sotthibundhu A, McDonagh K, von Kriegsheim A, et al. Rapamycin regulates autophagy and cell adhesion in induced pluripotent stem cells [J]. Stem Cell Res Ther,2016,7(1):166.