劉瑩

（寧波榮安生物藥業(yè)有限公司，浙江寧波 315800）

狂犬病是一類由病毒導致的病癥，引發(fā)狂犬病的病毒被稱為狂犬病病毒，具有致死率高、潛伏期長兩大顯著特點。事實上，狂犬病也并非想象中的那樣恐怖，通過有效措施和手段完全可以得到預防，預防狂犬病可以從以下三方面著手：（1）一旦被犬類咬傷后，應立即清洗傷口，為傷口消毒；（2）提前按規(guī)定在相關醫(yī)療機構接種狂犬病疫苗；（3）被犬類咬傷后，在不知其是否為病犬的情況下均到相關醫(yī)療機構注射抗狂犬病病毒血清或狂犬病免疫球蛋白[1-2]。

目前，市面上在售的預防狂犬病類的疫苗品種繁多，但劑型主要集中在液體制劑和凍干制劑兩種劑型，其中狂犬病疫苗凍干粉針劑型具有液體制劑所無可比擬的優(yōu)勢，值得大力推廣，其優(yōu)勢主要集中在運輸和儲存兩個方面。低溫真空冷凍干燥技術作為一項廣泛應用的制藥工程技術，其包括冷凍、升華、干燥等一系列復雜的工序，在整個工藝流程中各個參數(shù)必須被精準、完美地控制好才能制造出符合質量標準的合格疫苗[3-4]。但是，在步驟繁多的凍干工藝過程中，各種極端的低溫、凍結、干燥條件都會一定程度的破壞疫苗制品中的蛋白質；因此，為了保證凍干疫苗制品的良好品質需要在凍干工藝中加入一定的凍干保護劑；此外，本文所介紹的狂犬病疫苗表面具有刺突狀糖蛋白，該刺突狀糖蛋白極易脫落；在凍干工藝中添加合適的凍干保護劑可以防止其脫落，保證凍干狂犬病疫苗的穩(wěn)定性及免疫原性[5-6]。

以上介紹了凍干狂犬病疫苗凍干工藝中凍干保護劑的重要性，但選擇合適的凍干保護劑更是需要討論和重視的問題，其在很大程度上決定了可凍干狂犬病疫苗的成品品質。經(jīng)查閱大量相關凍干疫苗生產(chǎn)凍干保護劑工藝類文獻和收集大量相關配方、專利，并經(jīng)過多次小試研究，最終確定了以葡萄糖、右旋糖酐、乳糖、山梨醇、明膠為凍干狂犬病疫苗保護劑主成分的保護劑配方，本實驗對此配方中的主要影響因素，葡萄糖、右旋糖酐、明膠不同含量組合的保護效果進行比較，篩選最適配方。

1 材料與方法

1.1 疫苗原液

疫苗原液自行制備，狂犬病疫苗應用Vero細胞培養(yǎng)制備。

1.2 主要試劑

葡萄糖（廠商：Sigma，規(guī)格：100 g/瓶）、右旋糖酐（廠商：Sigma，規(guī)格：10 g/瓶）、乳糖（廠商：上海沃凱試劑有限公司，規(guī)格：10 g/瓶）、山梨醇（廠商：上海滬試試劑有限公司，規(guī)格：25 g/瓶）、明膠（廠商：上海滬試試劑有限公司，規(guī)格：500 g/瓶）。

1.3 供試液制備

以葡萄糖、右旋糖酐、乳糖、山梨醇和明膠為凍干狂犬病疫苗保護劑主成分的固定保護劑配方，改變葡萄糖、右旋糖酐、明膠的含量，制定6種保護劑配方，供試液為此6種保護劑配方分別與原液以1∶1的比例混合均勻，具體保護劑配方如下：（1）5%葡萄糖、3%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和1%明膠；（2）4.5%葡萄糖、3%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和1.2%明膠；（3）3.5%葡萄糖、2.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2%明膠；（4）5%葡萄糖、3.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2%明膠；（5）4.5%葡萄糖、3.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2.5%明膠；（6）5%葡萄糖、3%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2%明膠。

1.4 半成品的分裝凍干及成品檢測

將配制的6批半成品分裝至西林瓶中，0.5 mL/瓶，以同一凍干曲線進行凍干。對凍干后的成品進行外觀檢測，外觀合格的成品檢測其效力和熱穩(wěn)定性，并檢測其對應的半成品的效力，計算效力下降比率；同時根據(jù)2015版《中國藥典》第三部的要求對成品進行pH值、水分、Vero細胞DNA殘留量、牛血清白蛋白含量、細菌內毒素、異常毒性及無菌檢測，依據(jù)各項檢測結果確定最佳的凍干保護劑配方。

1.5 凍干保護劑的適用性驗證

應用篩選的最佳凍干保護劑配方制備6批半成品，并進行凍干制備成品，按規(guī)定進行檢測。

1.6 凍干保護劑的長期穩(wěn)定性驗證

對以上6批成品進行長期穩(wěn)定性考察，考察調節(jié)為4 ℃冷藏，0月、6月、12月為考察時間節(jié)點，取樣按規(guī)定進行相關項目檢測。

2 結果與分析

2.1 成品的檢測結果

2.1.1 外觀

僅從外觀來看，6批成品中有3批不合格、3批合格；3批不合格成品（批號4、5、6）的外觀主要呈現(xiàn)凍干塊萎縮、凹陷成窩、裂痕明顯等；3批合格成品（批號1、2、3）的外觀主要呈現(xiàn)為凍干塊白色疏松有序，通過進一步復溶試驗，結果顯示復溶速度快，溶液澄清透明，無雜質。

2.1.2 效力試驗及相關檢測項目

對比3批合格成品（批號1、2、3）凍干前后效力下降水平，批號1凍干前后效力下降約16.3%，批號2凍干前后效力下降約19.3%，批號3凍干前后效力下降約50%。進一步對批號1、批號2進行熱穩(wěn)定試驗，批號3由于凍干后效力下降過大已被排除。隨后對批號1、批號2進行標準中規(guī)定的檢測項檢測各項指標均合格。

2.1.3 凍干保護劑的篩選

批號1和批號2變量凍干保護劑配方分別為葡萄糖5%、右旋糖酐3%、明膠1%和葡萄糖4.5%、右旋糖酐3%、明膠1.2%；批號1和批號2成品所有檢測項均合格，基于生產(chǎn)配樣效率考慮，選擇配方1為最佳保護劑配方（3.5%葡萄糖、2.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇、2%明膠）。

2.2 凍干保護劑的適用性

以最佳凍干保護劑配方配制6批半成品凍干過程效價平均下降6.9%，熱穩(wěn)定效力下降14.8%，無論是凍干后還是熱穩(wěn)定性試驗后的效力均大于2.5 IU/劑，其他檢測指標均合要求。

2.3 凍干保護劑的長期穩(wěn)定性

6批成品的效價在12個月內無大幅下降，效價較穩(wěn)定，均大于2.5I U/劑，其他檢測指標均符合要求。

3 結論

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人畜共患病?？袢〔《緦儆趶棤畈《究瓶袢《緦?，其主要起效用的抗原是位于病毒表面包膜上的糖蛋白；該蛋白在形態(tài)上內嵌于病毒主體，形成一個個凸起。為了保證狂犬病病毒的穩(wěn)定性、有效性，狂犬病病毒疫苗最好的成藥方式是制成凍干粉針制劑，該劑型是狂犬病疫苗行業(yè)發(fā)展的必然趨勢[7-8]。目前，全球應用得最為廣泛的狂犬病疫苗品種均是凍干粉針劑型。

表1 6批成品檢測結果

真空低溫冷凍干燥特別適合一些對熱敏感的物質，疫苗就是一類對熱敏感的物質；不僅如此，凍干技術還可以最大程度的保持疫苗的活性和結構[9]。本研究旨在確定最佳的凍干保護劑配方，同時保證疫苗的效力及其他各項檢測指標符合標準規(guī)定。最終確定了3.5%葡萄糖、2.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇、2%明膠的最佳凍干保護劑配方。

葡萄糖能夠降低凍干過程對病毒包膜的傷害作用，葡萄糖的羥基與蛋白質中的極性基團形成氫鍵，從而代替蛋白質極性基團周圍和磷脂中的水分子，使蛋白質周圍形成水化膜，穩(wěn)定蛋白質的高級結構，防止蛋白質因凍干而變性，使疫苗在低溫冷凍和干燥失水的情況下，仍保持結構與功能的完整性。右旋糖苷在凍干制劑中起到支架作用，使凍干制品外觀呈白色疏松體。試驗中批號4、5、6配方中右旋糖酐含量較低，在該配方中作為支架的濃度不夠，因此凍干后外觀不合格。在應用明膠的可降解性時,經(jīng)常對其進行化學修飾,調控其降解速度以適應不同的需要。明膠于能抑制病毒聚集而使病毒穩(wěn)定，通過影響水分子的構象加強與蛋白質的疏水作用，抵抗熱變性，使蛋白質構象穩(wěn)定。明膠上的羥基能與病毒蛋白外殼中的羰基或氨基結合，能形成玻璃樣結晶顆粒，有效保持病毒外殼的空間構型，從而保持疫苗的活性。

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