丁振中，曾哲靈，龔勁松，張超，雷鵬，高小燕，徐俊山，張家宏

（1.揚州日興生物科技股份有限公司，江蘇揚州225601；2.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚州 225001）

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，土壤鹽漬化是影響農(nóng)作物生長并造成作物產(chǎn)量降低最常見的非生物脅迫。據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界鹽漬化土地的面積已超過10億公頃，而我國鹽漬化土地超過1億公頃[1]。土壤的鹽漬化會帶來嚴重的農(nóng)作物減產(chǎn)甚至絕收，因此，提高作物抗鹽的能力是保證我國糧食產(chǎn)量穩(wěn)定，促進國民經(jīng)濟發(fā)展的重要研究方向。

近年來，生物刺激素受到越來越多的關(guān)注。歐洲生物刺激素行業(yè)委員會提出，生物刺激素用于植物或植物根際后，能通過激發(fā)植物自身的生命過程來增強植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及利用效率或提高植物的抗非生物脅迫能力或改善作物品質(zhì)，生物刺激素可以是化學(xué)物質(zhì)或微生物。目前，已有一些生物聚合物被歐洲生物刺激素行業(yè)委員會認可作為生物刺激素，主要有腐植酸、幾丁質(zhì)、殼寡糖等[2]。然而，國內(nèi)針對殼寡糖在作物抗鹽方面的相關(guān)研究還比較少，基于此，本研究以油菜苗為對象，考察殼寡糖對油菜苗的抗鹽效果影響，并對其增強油菜苗的抗鹽機制進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長條件

以甘藍型油菜蘇油1號（油菜種子采購自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）作為研究對象，種子消毒后置于濕潤的濾紙上進行催芽，約3天后，將露白的種子播種于營養(yǎng)土中。油菜苗生長環(huán)境為本課題組的光照培養(yǎng)室，控制光照時間為16 h，光培養(yǎng)溫度控制為25℃，暗培養(yǎng)溫度15℃，控制培養(yǎng)室濕度為65%。待油菜苗生長4周后，選取長勢一致的油菜苗轉(zhuǎn)入水培盒（34 cm×23 cm×10 cm）進行水培培養(yǎng)。水培時使用1/2Hoagland營養(yǎng)液。水培一周，待油菜苗適應(yīng)水培環(huán)境后，開始施加實驗處理。

1.2 脅迫實驗處理

待油菜苗適應(yīng)水培環(huán)境后，設(shè)計4組處理，見表1。各處理組的油菜苗除在培養(yǎng)液中NaCl及殼寡糖的添加量不同外，其他培養(yǎng)條件均相同。營養(yǎng)液每隔24 h按表中的處理更換一次，油菜苗施加處理后分別于第48 h、96 h、144 h取樣進行各項生長及生理指標檢測。本實驗所有處理均設(shè)計3次重復(fù)。本研究中所用殼寡糖（COS）純品由揚州日興生物科技股份有限公司提供，分子量為2 kDa 。

表1 鹽脅迫實驗設(shè)計

1.3 生物量測定

測定油菜苗生物量時，每個處理每次取樣量均不少于6株苗，用吸水紙將油菜苗根部的營養(yǎng)液吸干，用剪刀將油菜苗分為地上部分和地下部分，然后置于105℃烘箱中殺青30 min，隨后將烘箱溫度調(diào)至80℃烘干24 h，分別稱取油菜苗地上部分和地下部分的干重。

1.4 油菜苗葉片中K+/Na+值測定

K+/Na+值的測定參考Gorham的方法[3]。稱取1.00 g葉片組織，加入5 mL去離子水研磨成勻漿，5000 g離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，定容后用火焰分光光度計測定K+、Na+濃度。

1.5 丙二醛（MDA）含量測定

MDA含量的測定參考Liu等人的方法[4]。稱取0.5 g葉片組織，用5%（w/v）的三氯乙酸溶液研磨成勻漿；勻漿液在12000 g條件下離心15 min，上清液與5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液（用20%的三氯乙酸溶液配制）混合；混合液置于沸水中加熱25 min，冷卻至室溫后，7500 g離心5 min。離心后測定上清液在450 nm、532 nm、600 nm波長下的吸光值。按照公式（1）計算葉片組織中MDA含量：

其中，C代表待測液中MDA濃度，A450、A532、A600分別代表待測液在在450 nm、532 nm、600 nm波長下的吸光值。

1.6 脯氨酸含量測定

脯氨酸含量的測定參考Bates的方法[5]。稱取葉片組織0.5 g，剪成碎片置于試管內(nèi)；向試管加入5 mL 3%磺基水楊酸，將試管置于沸水中浸提10 min；于試管內(nèi)取2 mL上清液，與2 mL乙酸、3 mL 2.5%酸性茚三酮顯色液混合后，沸水浴中加熱40 min；再向上述混合反應(yīng)液中加入4 mL甲苯，充分震蕩后靜置40 min；用移液器吸取上層甲苯層，在520 nm波長下測定吸光值。根據(jù)脯氨酸標準品在520 nm波長下吸光值繪制的標準曲線，即可計算出葉片組織中萃取的脯氨酸濃度。

1.7 抗氧化酶活力的測定

粗酶液的提取參考Abedi等的方法[6]。稱取0.5 g葉片組織，在1.5 mL Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，含5%的蔗糖和0.1%的巰基乙醇）中研磨成勻漿；4℃下離心20 min；上清液即為粗酶液，用于測定超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）、過氧化氫酶（CAT，EC 1.11.1.6）和過氧化物酶（POD，EC 1.11.1.7）的活力。粗酶液蛋白含量按照Bradford的方法，即考馬斯亮藍法進行測定。

SOD活力的測定參考Abedi等的方法[6]。吸取0.1 mL上述粗酶液，與1.5 mL50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8，內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）、0.3 mL130 mmol/L甲硫氨酸溶液（用磷酸緩沖液配制）、0.3 mL750 μmol/L氮藍四唑溶液（用磷酸緩沖液配制）、0.3 mL100 μmol/L EDTA-Na2溶液（用磷酸緩沖液配制）、0.3 mL20 μmol/L核黃素溶液（用磷酸緩沖液配制）及0.5 mL去離子水混合，將混合溶液置于4000 lx日光燈下反應(yīng)20 min，反應(yīng)液為樣品組；以0.1 mL磷酸緩沖液替代上述混合液中的粗酶液，在4000 lx日光燈下反應(yīng)20 min，反應(yīng)液作為對照組；以0.1 mL磷酸緩沖液替代上述混合液中的粗酶液，在黑暗條件下反應(yīng)20 min，反應(yīng)液作為空白組；測定各組反應(yīng)液在560 nm波長下的吸光值。SOD酶活定義為抑制50%氮藍四唑還原所需要的酶量，SOD酶活表示為U/mgprotein。

CAT活力的測定參考Abedi等的方法[6]。用移液器分別將0.1 mL 2% H2O2和2 mL50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0，含1%聚乙烯吡咯烷酮、0.1%巰基乙醇）加入1 cm比色皿中，再加入0.1 mL粗酶液，常溫下混勻，立即在240 nm波長下5 min內(nèi)測定吸光值，每隔1 min讀一次數(shù)，直至每分鐘的吸光值降低量達到穩(wěn)定。CAT的活力定義為每分鐘H2O2的減少量，表示為mmol/(min·g) protein。

POD活力的測定參考Zhou和Leul的方法[7]。吸取0.1 mL粗酶液，與2.9 mL50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0，含1%聚乙烯吡咯烷酮、0.1%巰基乙醇）、0.5 mL 2%H2O2溶液、0.1 mL 2%愈創(chuàng)木酚溶液混合；混合液直接在470 nm波長下測定吸光值，每隔1 min記錄一次，共記錄5次。POD活力定義為每分鐘愈創(chuàng)木酚的氧化量，表示為nmol/(min·mg) protein。

2 結(jié)果與討論

2.1 NaCl脅迫下殼寡糖對油菜苗生物量的影響

NaCl脅迫下殼寡糖對油菜苗生物量影響的實驗結(jié)果見表2。如表2所示，在非脅迫條件下殼寡糖能促進油菜苗的生長。處理144 h后，與CK組相比，NaCl脅迫顯著抑制了油菜苗的生長，但在添加了殼寡糖的條件下（NaCl+COS組），油菜苗全植株、地上部分以及地下部分的干重比NaCl組分別顯著提高了37.4%、38.8%和34.1%。結(jié)果表明，殼寡糖緩解了鹽脅迫對油菜苗生長的抑制。一般來說，在高鹽環(huán)境中，植物生物量的提高與其所處的生理環(huán)境有關(guān)，生物量的增加意味著植物體內(nèi)的離子分布更合理，所受的活性氧（ROS）毒害更少，其自身滲透調(diào)節(jié)能力更強[8]。因此，殼寡糖能緩解鹽脅迫導(dǎo)致的生物量降低，說明其對油菜苗的離子平衡、滲透調(diào)節(jié)、ROS清除等生理過程產(chǎn)生了影響。

2.2 殼寡糖對K+/Na+值的影響

在鹽脅迫條件下，細胞內(nèi)的K+/Na+值通常能夠反映植物受到的鹽傷害程度。受到NaCl脅迫時，環(huán)境中的Na+會取代K+轉(zhuǎn)運進入細胞內(nèi)，從而降低細胞內(nèi)的K+/Na+值，過量的Na+在細胞內(nèi)會對細胞產(chǎn)生毒害[9]。NaCl脅迫下殼寡糖對油菜苗葉片中K+/Na+值的影響如圖1所示。在非脅迫條件下，殼寡糖處理（COS組）能顯著提高油菜苗葉片內(nèi)的K+/Na+值，特別是在施加處理96 h后。在NaCl脅迫下，油菜苗葉細胞內(nèi)的K+/Na+值顯著地降低，特別是在處理后144 h，NaCl組中的K+/Na+值與CK組中的K+/Na+值相比下降了97.1%。然而，在取樣時間內(nèi)，殼寡糖的施用（NaCl+COS組）則在一定程度上緩解了NaCl引起的K+/Na+值的降低。在144 h時，NaCl+COS組中油菜苗葉片內(nèi)的K+/Na+值是NaCl組的8倍。以上結(jié)果表明，鹽脅迫環(huán)境下，殼寡糖能在一定程度上緩解NaCl引起的K+/Na+值的降低。

圖1 NaCl脅迫下殼寡糖對油菜苗葉片中K+/Na+值的影響

表2 NaCl脅迫下殼寡糖對油菜苗全植株、地上部分和地下部分干重的影響

2.3 NaCl脅迫下殼寡糖對MDA含量的影響

高鹽脅迫還會引起ROS在植物細胞內(nèi)大量積累，從而進一步造成對細胞的氧化脅迫，由過剩ROS引起的膜脂氧化一般被認為是高鹽脅迫對細胞的主要傷害。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，通常細胞內(nèi)的MDA濃度能直接反映ROS對植物細胞的傷害程度[10]。殼寡糖對MDA含量的影響如圖2所示。與CK組相比，COS組中油菜苗葉片內(nèi)的MDA含量無顯著變化。但在NaCl脅迫條件下，油菜苗葉片內(nèi)的MDA含量顯著提高。盡管NaCl組與NaCl+COS組中油菜苗葉片內(nèi)的MDA含量均顯著高于CK組，但在取樣時間內(nèi)，NaCl+COS組中MDA含量始終顯著低于NaCl組。在144 h時，與NaCl組相比，NaCl+COS組中MDA含量減少了16.7%。以上結(jié)果表明，鹽脅迫引起了油菜苗葉片中MDA含量的增加，而殼寡糖可以顯著緩解鹽脅迫導(dǎo)致的MDA含量提高，這說明，殼寡糖對鹽脅迫環(huán)境下ROS的清除起著積極的作用。

圖2 NaCl脅迫下殼寡糖對油菜苗葉片中MDA含量的影響

2.4 殼寡糖對抗氧化酶活力的影響

本研究考察了殼寡糖對SOD、CAT、POD3種抗氧化酶活力的影響。這3種酶是植物體內(nèi)清除過剩ROS的主要酶系，植物在受到鹽脅迫后能夠通過增強這3種抗氧化酶來緩解鹽脅迫引起的氧化脅迫[11]。殼寡糖對抗氧化酶的影響如圖3所示。在本研究中，SOD、CAT、POD具有相似的變化趨勢，在非脅迫環(huán)境下，3種抗氧化酶受COS影響（COS組），其活力均呈現(xiàn)出上調(diào)的趨勢。在NaCl脅迫環(huán)境下（NaCl組），3種酶的活力顯著提高，但隨著脅迫時間的延長，在144 h時，酶活呈現(xiàn)降低的趨勢；而在使用殼寡糖后（NaCl+COS組），3種酶的酶活不僅在取樣時間內(nèi)顯著高于NaCl組，而且在取樣時間內(nèi)，始終呈現(xiàn)高活力狀態(tài)。因此，殼寡糖有助提高油菜苗葉片內(nèi)的SOD、CAT、POD活力，并且在NaCl脅迫環(huán)境下這種增強效果更為顯著。因此，NaCl脅迫環(huán)境下，殼寡糖能顯著提高油菜苗葉片中3種抗氧化酶的活力，這說明在高鹽脅迫環(huán)境中殼寡糖增強了油菜苗清除過剩ROS的能力，從而降低了膜脂的氧化程度，減少了胞內(nèi)MDA的產(chǎn)生。

圖3 NaCl脅迫下殼寡糖對油菜苗葉片中SOD（A）、CAT（B）和POD（C）活力的影響

2.5 殼寡糖對脯氨酸積累的影響

在高鹽環(huán)境中，植物還會通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來應(yīng)對脅迫引發(fā)的胞內(nèi)外滲透壓失衡，對于大部分植物，通過在細胞內(nèi)積累脯氨酸等小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是應(yīng)對滲透壓失衡的主要策略[12]。殼寡糖對脯氨酸的積累如圖4所示。與CK組相比，COS組中油菜苗葉片內(nèi)的脯氨酸含量呈明顯上升趨勢，特別是在施加處理96 h之后。在鹽脅迫環(huán)境中，油菜苗葉片內(nèi)的脯氨酸含量顯著提高，并且NaCl+COS組中脯氨酸含量顯著高于NaCl組，特別是在施加處理96 h后。在144 h時，NaCl+COS組中油菜苗葉片內(nèi)的脯氨酸含量達到3.505 mg/g FW，比NaCl組高出36.5%。結(jié)果表明，無論是否在鹽脅迫環(huán)境下，殼寡糖均能促進油菜苗葉片內(nèi)脯氨酸的積累，但在鹽脅迫環(huán)境中，殼寡糖使脯氨酸的積累更為顯著。

圖4 NaCl脅迫下殼寡糖對油菜苗葉片中脯氨酸（proline）含量的影響

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，殼寡糖即使在非脅迫條件下也能促進油菜苗脯氨酸的積累，而脯氨酸除了是一種小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還能作為信號分子來調(diào)控離子平衡、穩(wěn)定細胞酶活，以及啟動特定基因的表達，這對植物應(yīng)對高鹽環(huán)境都至關(guān)重要[13]。Khedr等人發(fā)現(xiàn)，脯氨酸能夠誘導(dǎo)鹽脅迫相應(yīng)蛋白的表達[14]；Sobahan等人發(fā)現(xiàn)外源施用脯氨酸能夠有效抑制鹽脅迫環(huán)境中植物對Na+的吸收，增強植物對K+的吸收，提高細胞內(nèi)的K+/Na+值[15]；Yan等人報道外源施用脯氨酸還能提高SOD、CAT、POD等抗氧化酶的活力，從而降低脅迫環(huán)境中植物細胞內(nèi)的ROS水平[16]。因此，筆者推測，殼寡糖能夠緩解油菜苗遭受NaCl脅迫時的Na+毒害以及氧化傷害，與其促進油菜苗細胞內(nèi)的脯氨酸積累有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究以水培油菜為研究對象，考察鹽脅迫條件下殼寡糖對油菜生長的影響。結(jié)果顯示，NaCl顯著抑制油菜苗生長，但施用了殼寡糖后，油菜苗的全植株干重、地上部分干重、地下部分干重分別提高了37.4%、38.8%和34.1%，說明殼寡糖確實能緩解鹽脅迫對植物的傷害。研究還發(fā)現(xiàn)，100 mmol/LNaCl脅迫環(huán)境下，殼寡糖在一定程度上抑制了油菜苗細胞內(nèi)K+/Na+值的降低和丙二醛（MDA）含量的增加；此外，殼寡糖增加了脯氨酸的積累，增強了抗氧化酶（SOD、CAT、POD）的活力。上述結(jié)果說明殼寡糖提高了油菜苗在鹽脅迫下的滲透調(diào)節(jié)能力和ROS清除能力?？紤]到殼寡糖在非脅迫條件下也能促進脯氨酸積累，本研究認為，殼寡糖激活了脯氨酸的合成途徑，提高了油菜苗細胞內(nèi)脯氨酸的積累量，從而增強了油菜苗鹽脅迫下的耐受能力。

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