吳 爽 ，黎 明 ，眭 丹 ，李作明 ，周玉香

（1.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏中牧億林種羊場，寧夏 銀川 750021；3.寧夏魯寧小尾寒羊種羊場，寧夏 銀川 750021）

為了延長精液保存時間、增加人工授精用精液的生產(chǎn)量，實踐中往往在鮮精液中加入一定量的保護溶液，即通常所說的“稀釋液”。稀釋液中常加入一些保護劑成分，常用的有糖類、抗凍劑、非電解質、抑菌物質和抗氧化物質等[1]。糖類對于精子的作用是維持其活力，目前稀釋液中常用的有蔗糖、葡萄糖和果糖。糖類的選擇因畜禽品種而異，普遍認為果糖較好，但其價格昂貴。生產(chǎn)中也有1～2種糖合用的情況。常溫下，糖類對精子具有保護作用，但其機理尚不清楚。研究表明，由乳糖、葡萄糖、檸檬酸三鈉組成的稀釋液對山羊精液的保存效果較為理想[2]。

精子在附睪中處于弱酸環(huán)境，射精后副性腺分泌物偏中性，射出后的精液pH值在7.0左右。緩沖劑能夠起到調整精液酸堿度的作用，防止pH值過大或過小。常用的緩沖劑有檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉（鉀）和三羥甲基甲烷，這些緩沖劑對精子代謝性酸中毒和酶活動反應具有良好的緩沖作用，國內目前稀釋液中常用的基礎液是磷酸鹽緩沖液（PBS），其pH值接近精液并且與精液基本等滲透壓[3-4]。

由于樂至黑山羊采精量少，且通常采用鮮精進行人工授精，導致樂至黑山羊養(yǎng)殖數(shù)量受限，養(yǎng)殖成本增高。近年來，人們對種羊的精液稀釋液進行了大量的研究，并取得了一定的成果。該研究旨在通過評價檸檬酸-Tris、磷酸鹽和OviXcell 3種稀釋液對樂至黑山羊精液冷凍保存效果的影響，為生產(chǎn)實踐中科學選擇山羊精液稀釋液，提高山羊精液利用效率提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和儀器

檸檬酸，磷酸氫二鈉，甘油，Tris堿，果糖，磷酸二氫鈉，青霉素，卵黃，顯微鏡，電子秤，量筒，燒杯，移液槍頭，染色缸，蒸餾水，鑷子，移液槍，載玻片，蓋玻片，計數(shù)器，冰箱，秒表。

1.2 稀釋液的配制

1號稀釋液為檸檬酸-Tris稀釋液，配方為果糖 1 g，檸檬酸 1.4 g，Tris堿 2.42 g，甘油 10 mL；2號稀釋液為磷酸鹽稀釋液，配方為果糖3.5 g，磷酸二氫鈉0.4 g，磷酸氫二鈉0.2124 g，甘油10 mL；3號稀釋液為OviXcell稀釋液。以上稀釋液定容至100 mL容量瓶。1號與2號稀釋液均加入少許青霉素。3種稀釋液每種各吸取8份，每份1.5 mL。避免振蕩、光照，并盡快采集新鮮精液加入其中以進行精子品質檢測。

1.3 精液的采集與稀釋

選擇寧夏中牧億林股份有限公司8只健康種用樂至黑山羊，采用假陰道法采集新鮮精液，每只羊分別采集3次，每只樂至黑山羊每次采集精液0.5～1.4 mL。采集的精液應用配制好的稀釋液進行2倍稀釋，微微搖勻，置于常溫環(huán)境。將采樣管用紗布包裹，置于4℃條件下平衡2 h，觀察精子活力，在70%以上即可冷凍。于常溫下解凍后，觀察精液保存效果。

1.4 精液保存效果評價指標的測定

1.4.1 精子活力的測定：將滴有稀釋精液的載玻片加熱至37℃，在400倍顯微鏡下觀察并記錄。精子活力=呈直線運動的精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.4.2 精子畸形率的測定：將解凍后的精液取1滴平滴于載玻片的右端，取另一張邊緣光滑平直的蓋玻片呈35°角，自精液滴的左面向右接觸樣品，將上面的蓋玻片貼著平置的載玻片表面，自左向右移動，帶著精液均勻地涂抹在載玻片上，自然晾干后，用中性福爾馬林固定15 min，水洗后晾干，用滴管吸取配制的Giemsa染液約2.5 mL，均勻涂于抹片上，使染液涂滿抹片后靜止染色70 min左右，清水漂洗后晾干，在顯微鏡下觀察，每個抹片觀察200個以上的精子。畸形包括頭部畸形、頸部畸形、尾部畸形。精子畸形率=畸形精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.4.3 精子頂體完整率的測定：方法同上。精子頂體不完整情況分為：頂體膨脹型、部分破損型、頂體全脫型。精子頂體完整率=頂體完整的精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0軟件，采用方差分析法對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 3種稀釋液對精子活力的影響

由表1可知，在采集后精子的活力差異不顯著（P＞0.05）。平衡后3種稀釋液中，1號的精子活力最差，3號的精子活力最強，但組間差異不顯著（P＞0.05）。解凍后，1號的精子活力最差，3號的精子活力最強，但各組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表1 3種稀釋液對樂至黑山羊精子活力的影響 %

2.2 3種稀釋液對精子畸形率的影響

由表2可知，在3種稀釋液中，3號的精子畸形率最低，2號的精子畸形率最高，但組間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 3種稀釋液對樂至黑山羊冷凍精子畸形率的影響 %

2.3 3種稀釋液對精子頂體完整率的影響

由表3可知，在3種稀釋液中，1號稀釋液的精子頂體完整率最低，3號稀釋液的精子頂體完整率最高，但組間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 3種稀釋液對樂至黑山羊冷凍精子頂體完整率的影響 %

3 討論

3.1 3種稀釋液對精子活力的影響

研究表明，冷凍復蘇后的精子，超微結構未發(fā)生改變的只占冷凍精子總數(shù)的8.8%，發(fā)生超微結構改變的精子呈現(xiàn)出精子外膜變薄，波浪狀改變或破損，胞質、頂體內和線粒體內透光度增加，頂體增寬，甚至頂體外膜破裂，線粒體外形變圓，軸絲增粗等[5]。頂體膜的損傷或破裂，必然導致精子頂體酶活性降低；精子外膜損傷或破裂，精子膜功能受損，則精子存活率呈顯著下降趨勢，這與該試驗結果一致。已有研究表明，精子冷凍可使線粒體結構和功能遭受破壞，ATP生成障礙，進而影響精子的活力[6]。

在該試驗中，筆者將3種稀釋液應用于樂至黑山羊精液的低溫保存，研究采用的是平衡后顆粒凍精快速降溫的方法。結果表明，在相同情況下進行解凍后，添加OviXcell稀釋液的精液與添加另外2種稀釋液的精液相比，其精子活力最強。

3.2 3種稀釋液對精子畸形率的影響

隨著精子保存溫度的降低，精子畸形率顯著增加。經(jīng)過冷凍處理后的雞精子，畸形率超過了20%，說明低溫環(huán)境和冷凍操作對精子形態(tài)造成了顯著的有害影響，在升溫或解凍后形成不可逆的畸形率增加，造成精子活率降低，導致母雞受精率隨之下降。另外，低溫保存后精子尾部畸形增多，說明低溫環(huán)境對雞精子細長的尾部有顯著的負面影響，這是由于低溫環(huán)境使精子休眠后尾部形態(tài)發(fā)生不規(guī)則卷曲，其原因尚有待于進一步觀察[7-8]。

該研究結果表明，在相同情況下進行解凍后，添加OviXcell稀釋液的精液與添加另外2種稀釋液的精液相比，其精子畸形率最低，而添加3種稀釋液冷凍保存的精液解凍后其精子畸形率之間差異均不顯著（P＞0.05）。

3.3 3種稀釋液對精子頂體完整率的影響

精子的頂體是完成受精過程的重要細胞器，頂體完整率越高，存活指數(shù)越大，精子的存活時間越長[9]。 由于羊原精中鈉的含量較高[9]，精液中的鈉可以與稀釋液中的檸檬酸結合，維持精液的滲透壓，有利于提高精子活力，使頂體完整率增加。

該研究結果表明，在相同情況下進行解凍后，添加OviXcell稀釋液的精液與添加另外2種稀釋液的精液相比，其精子頂體完整率最高，而添加3種稀釋液冷凍保存的精液解凍后其精子頂體完整率之間差異均不顯著（P＞0.05）。

4 結論

OviXcell稀釋液更適用于樂至黑山羊精液的體外冷凍保存。

[1]楊燦鋒，楊利國，蔣杰.幾種常用營養(yǎng)試劑對波爾山羊精子活率的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002（6）：18-19.

[2]李助南，郭良輝，袁微，等.不同稀釋液對山羊精液的保存效果[J].湖北農學院學報，2001，21（3）：20-22.

[3]權凱，黃炎坤.雞精液稀釋液研究進展[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2006，26（2）：4-5.

[4]MAHADEVAN M M，TROUNSON A O.Relationship of fine structure of sperm head to fertility of frozen human semen[J].Fertility and Sterility，1984，41（2）：287-293.

[5]于德新，尤國才，徐正銓，等.冷凍保存的人類精子超微結構變化[J].男科學雜志，1995，9（3）：148-151.

[6]王欣榮，李彥強.保存條件對雞精子形態(tài)及畸形率的影響[J].黑龍江動物繁殖，2009，17（6）：5-6.

[7]劉建忠.影響雞精液體外低溫保存效果因素的分析[J].畜牧獸醫(yī)雜志，1997（2）：51-52.

[8]李青旺，武浩.動物繁殖學[M].西安：西安地圖出版社，2000：9.

[9]北京農業(yè)大學.家畜繁殖學[M].北京：中國農業(yè)出版社，1982：9.