謝晴晴， 歐陽(yáng)博慧， 李 恩， 畢忠平， 朱勝波， 唐 健， 孫一帆

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 柳州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 柳州 545001 ；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳鐵中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 柳州 545007 ）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國(guó)南方及東南沿海一帶常見(jiàn)的惡性腫瘤。迄今為止，NPC的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。目前，多認(rèn)為NPC是一種涉及多個(gè)基因之間或基因與環(huán)境之間交互作用的多基因遺傳病。γ干擾素（interferon gamma，IFN-γ）是病毒感染機(jī)體后，由細(xì)胞分泌的具有抗病毒功能的宿主特異性糖蛋白，可激活單核吞噬細(xì)胞殺傷微生物，通過(guò)激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷感染的靶細(xì)胞。已有研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ基因多態(tài)性和腫瘤的發(fā)生相關(guān)[1-2]，但目前未見(jiàn)關(guān)于IFN-γ基因多態(tài)性與NPC易感性相關(guān)性的報(bào)道。我們研究了最常見(jiàn)的IFN-γ基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2430561（+874T/A）和rs1861494（+2109A/G）與NPC易感性的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年4月—2016年4月在柳州市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科就診的NPC患者（病例組）共150例，其中男126例、女24例，年齡（47.28±9.58）歲。所有患者均行鼻咽鏡檢查，病理診斷明確。另選取柳州市中醫(yī)醫(yī)院體檢科體檢健康者150名作為對(duì)照組，其中男130名、女20名，年齡（49.03±11.28）歲，且年齡、性別比例與病例組相匹配。本研究遵循倫理學(xué)原則，所有研究對(duì)象自愿參加，均已知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 抽取研究對(duì)象乙二胺四乙酸二鈉抗凝靜脈血2.0 mL，按照常規(guī)酚氯仿方法提取DNA，紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Nano Dropzooc公司）檢測(cè)DNA質(zhì)與量，合格后作為擴(kuò)增模板置-20 ℃保存。

1.2.2 基因分型 +874T/A位點(diǎn)采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-序列特異引物技術(shù)（sequence-specif i c primer，SSP），+2109A/G位點(diǎn)采用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）進(jìn)行分型。引物由生工生物工程（上海）有限公司代為合成。見(jiàn)表1。

表1 各檢測(cè)位點(diǎn)的引物和限制性內(nèi)切酶

+874T/A位點(diǎn)PCR擴(kuò)增總體積為15.0 μL，其中Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）7.5 μL，上、下游引物各0.6 μL，內(nèi)參上、下游引物各0.15 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌去離子水4.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)10次，再94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)23次，最后72 ℃延伸5 min。+2109A/G位點(diǎn)PCR擴(kuò)增總體積為20.0 μL，其中Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）10.0 μL，上、下游引物各1.06 μL， DNA模板1.0 μL，滅菌去離子水7.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增后，+2109A/G用MspI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切后配制2.0%的瓊脂糖凝膠，吸取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物和50 bp Marker上樣電泳，電泳條件為100 V電壓，時(shí)間為65 min，銀染法進(jìn)行結(jié)果的觀察和判讀，凝膠成像儀拍照分析。+874T/A位點(diǎn)擴(kuò)增后電泳圖即為最終基因分型圖。

1.3 各位點(diǎn)基因測(cè)序分型鑒定

病例組和對(duì)照組隨機(jī)抽取20%的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送交生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，測(cè)序圖譜采用DNAMAN軟件進(jìn)行識(shí)別。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。病例組和對(duì)照組各SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)；用Logistic回歸分析校正年齡、性別等混雜因素，計(jì)算相應(yīng)的比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)使用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用χ2檢驗(yàn)分析各SNP位點(diǎn)基因型頻率的分布是否符合HWE平衡，符合HWE平衡時(shí)P＞0.05。

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果

+874位點(diǎn)野生基因型為T(mén)T，在電泳圖上可見(jiàn)加了上游引物1（含特異堿基T）的擴(kuò)增管在303 bp處有條帶出現(xiàn)，而加入了上游引物2（含特異堿基A）的擴(kuò)增管在303 bp處無(wú)條帶出現(xiàn)；突變基因型AA與之相反；雜合子TA 2管都有條帶出現(xiàn)。內(nèi)參對(duì)照帶為400 bp，每管都必須有內(nèi)參對(duì)照條帶出現(xiàn)，見(jiàn)圖1（a）。直接測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證基因分型結(jié)果完全正確[圖1（b）]。

圖1 病例組和對(duì)照組基因分型結(jié)果

+2109位點(diǎn)酶切序列為G，酶切片段分別有22、245、267 bp。由于22 bp片段太小，電泳后跑出了凝膠。故電泳圖根據(jù)如下判讀：（1）1條帶267 bp，表示不能切開(kāi)，為AA基因型；（2）1條帶245 bp，表示完全切開(kāi)，為GG基因型；（3）2條帶245和267 bp，表示部分切開(kāi)，為AG基因型。+2109位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后結(jié)果見(jiàn)圖1（c）。直接測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證基因分型結(jié)果完全正確[圖1（d）]。

2.2 +874T/A位點(diǎn)基因型及等位基因型與NPC易感性的關(guān)系

+874位點(diǎn)病例組和對(duì)照組各基因型實(shí)際頻率與預(yù)計(jì)頻率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.926，P=0.087），符合HWE平衡。以AA基因型為參考，將病例組與對(duì)照組進(jìn)行比較，并利用Logistic回歸分析校正性別和年齡因素。病例組與對(duì)照組比較（TT與AA）：OR=0.132，95%CI=0.022～0.800，P=0.028。等位基因T與A比較，經(jīng)校正病例組與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。+874T/A位點(diǎn)各基因模式比較患病風(fēng)險(xiǎn)及95%CI見(jiàn)表2。

2.3 +2109A/G位點(diǎn)基因型及等位基因型與NPC易感性的關(guān)系

+2109位點(diǎn)病例組和對(duì)照組各基因型實(shí)際頻率與預(yù)計(jì)頻率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.926，P=0.370），病例組和對(duì)照組標(biāo)本符合HWE平衡。以AA基因型為參考，將病例組與對(duì)照組進(jìn)行比較，并利用Logistic回歸分析校正性別和年齡因素。各基因模型比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。等位基因G與野生型A比較，經(jīng)校正后的結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。+2109A/G位點(diǎn)基因模式比較患病風(fēng)險(xiǎn)及95%CI見(jiàn)表2。

表2 各位點(diǎn)基因型及等位基因型頻率與NPC易感性的關(guān)系

3 討論

IFN-γ作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，其基因多態(tài)性在癌癥的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用。本研究結(jié)果顯示，病例組與對(duì)照組比較，IFN-γ基因+874位點(diǎn)野生基因型TT患病風(fēng)險(xiǎn)是突變基因型AA的0.132倍（95%CI=0.022～0.800，P=0.028）。因此，IFN-γ基因+874位點(diǎn)TT基因型是廣西地區(qū)慢性肝炎的保護(hù)基因。已有研究發(fā)現(xiàn)在高危人乳頭瘤病毒感染患者IFN-γ基因+874位點(diǎn)基因分布頻率中AA基因型是TT基因型的4倍，AA基因攜帶者感染人乳頭瘤病毒的概率是TT基因攜帶者的1.7倍，因此AA基因型可能會(huì)影響女性人乳頭瘤病毒感染的自我清除，是宮頸癌發(fā)生的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素[3-4]。相反，T基因由于可以促進(jìn)IFN-γ的高表達(dá)，可能在癌癥發(fā)生中起到了保護(hù)作用，如T基因攜帶者食管癌的發(fā)生概率較其他基因型低[5]。此外，IFN-γ基因+874位點(diǎn)基因多態(tài)性還和卵巢癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[6]。

IFN-γ基因多態(tài)性能通過(guò)以下途徑導(dǎo)致癌癥的發(fā)生：（1）乙型肝炎病毒感染是肝癌發(fā)生的主要因素之一，IFN-γ基因+874位點(diǎn)AA基因型的IFN-γ產(chǎn)量最低，陳永琴等[7]發(fā)現(xiàn)IFN-γ水平與乙型肝炎病毒清除力相關(guān)，IFN-γ水平越高，乙型肝炎病毒DNA載量越低[7]；此外，突變會(huì)影響IFN-γ與細(xì)胞表面干擾素受體的結(jié)合，也導(dǎo)致病毒清除能力下降，使癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加[8]。（2）IFN-γ基因+874位點(diǎn)是核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合點(diǎn)，其基因多態(tài)性通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平影響這一信號(hào)通路，導(dǎo)致氧自由基損害，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[8]。（3）IFN-γ產(chǎn)量的下降也會(huì)影響雙鏈RNA依賴蛋白質(zhì)激酶、死亡受體、腫瘤壞死因子α受體在細(xì)胞表面的表達(dá)，使細(xì)胞分化增殖和凋亡調(diào)控受到干擾，容易導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[9]。

IFN-γ基因+2109位點(diǎn)和+874位點(diǎn)一樣，都是核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合點(diǎn)，其基因多態(tài)性能通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平影響這一信號(hào)通路，導(dǎo)致氧自由基損害，從而導(dǎo)致肝硬化和肝纖維化的發(fā)生[8]。本研究將病例組與對(duì)照組相比較，進(jìn)行患病風(fēng)險(xiǎn)的各種基因模型比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，本研究結(jié)果表明IFN-γ基因+2109位點(diǎn)基因多態(tài)性與廣西地區(qū)NPC患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。

不同的研究可以發(fā)現(xiàn)IFN-γ基因+874位點(diǎn)和+2109位點(diǎn)基因多態(tài)性與疾病易感性也不同。比如來(lái)自巴西的研究認(rèn)為，+874位點(diǎn)A基因攜帶者發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)與TT基因型相比更低[10-11]，存在這種差別的主要原因是由于廣西地區(qū)人群A基因突變率明顯高于巴西人群，野生型TT基因型顯著偏低。本研究結(jié)果表明，廣西地區(qū)IFN-γ基因+874位點(diǎn)以純合突變AA基因型為主，其次為雜合子AT，而野生型純合子TT最少，所占比例也非常低。我們的研究與2009年藍(lán)艷等[12]在廣西調(diào)查的結(jié)果一致，與武漢[13]的研究結(jié)果也無(wú)顯著差別，但與河北[14]、山東[15]和溫州[16]的結(jié)果存在明顯差別。

總之，本研究結(jié)果提示IFN-γ +874位點(diǎn)基因多態(tài)性與NPC易感性相關(guān)聯(lián)，但還需多種族和更大的樣本量的研究來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

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