王 平， 戴研平， 楊 薇， 岳應(yīng)權(quán)， 高曉勤

（1. 遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校，貴州 遵義 563002；2. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；3. 貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院檢驗(yàn)系，貴州 貴陽 550004）

酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機(jī)磷酸的水解酶。主要存在于巨噬細(xì)胞中，定位于溶酶體、高爾基復(fù)合體及細(xì)胞核內(nèi)，在溶酶體膜遭到破壞時，酶活力被顯示。人的精液中富含ACP，精漿ACP的降低能夠影響精子的數(shù)量和質(zhì)量，是男性少精不育的重要原因[1]。細(xì)胞凋亡是一種由相關(guān)基因調(diào)控的細(xì)胞主動死亡過程[2]。生精細(xì)胞凋亡在精子的發(fā)生、發(fā)育、成熟過程中起著重要的作用，是機(jī)體清除過量或異常生精細(xì)胞的一種重要方式。然而，生精細(xì)胞過度凋亡則可能是病理現(xiàn)象，會導(dǎo)致生育力降低甚至不育[3-4]。大量研究表明，生精細(xì)胞凋亡與睪丸中睪酮、黃體生成素、血清抑制素B水平的顯著減少密切相關(guān)[5-7]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約有8 000萬對夫婦罹患不育，其中40%為男性不育，臨床上至今仍缺乏有效的治療方法。目前有關(guān)不育患者生殖細(xì)胞內(nèi)ACP與凋亡關(guān)系的研究尚未見報道。本研究采用技術(shù)水平較先進(jìn)的酶組化電鏡，從超微結(jié)構(gòu)的角度進(jìn)一步探討精子和生精細(xì)胞內(nèi)ACP活性與凋亡細(xì)胞間的內(nèi)在聯(lián)系，為臨床上男性不育癥的診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

10例男性少精不育患者（不育組）為貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診患者，年齡24～38歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)世界衛(wèi)生組織推薦的女方婦產(chǎn)科檢查正常，婚后2年正常性生活但不育、精液常規(guī)檢查中精子數(shù)量＜20×106/L，無家族遺傳病史，無外傷。正常生育組10名，年齡25～27歲，精液常規(guī)檢查正常，已生育1個或2個子女。

1.2 主要儀器及試劑

固定液的配制：2.5%戊二醛（0.1 mmol/L、pH值7.4二甲胂酸鈉，8%蔗糖）。孵育液的配制：0.05 mmol/L（pH值4.7～4.8）醋酸鈉緩沖液50 mL，蔗糖4 g，硝酸50 mg，3% β-甘油磷酸鈉1.50 mg/5 mL雙蒸水。上述藥液依次加入，以1 mmol/L HCl調(diào)至pH值6.6，用前過濾。

1.3 方法

不育組和正常生育組均禁欲7 d后，手淫法采集精液標(biāo)本于無菌培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)箱液化1 h，取出備用。緩慢注入離心管中，離心后沉淀，用2.5%戊二醛（固定液）前固定6 h，然后用0.1 mmol/L 二甲胂酸鈉（pH值7.2～7.4 ）充分洗滌。洗滌后的精子于孵育液內(nèi)37 ℃孵育1～2 h，在室溫下漂洗后再次離心，用鋨酸固定液后固定，然后按常規(guī)透射電鏡標(biāo)本制作方法進(jìn)行操作。取部分前固定后的精子加入氧化鈉作用液（0.01 mL）中孵育，作為陰性對照。ACP水平測定采用磷酸苯二鈉法，試劑購自泰安聯(lián)星公司，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所得數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACP的活性

除陰性對照無ACP陽性反應(yīng)外，所有的精子頭頂體及赤道板處均可見顯示少量ACP陽性反應(yīng)的棕黑色沉淀。具有特征性的是不育組10例標(biāo)本中，有7例可見脫落生精細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，并見有大量與鉛結(jié)合的ACP沉淀于生精細(xì)胞溶酶體內(nèi)[圖1（a）]。有6例見巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞吞噬凋亡的精子和生精細(xì)胞。被吞噬的凋亡細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器消失，細(xì)胞外形可見，有的裂變成為凋亡小體，有的膜性結(jié)構(gòu)形成大量的囊泡狀結(jié)構(gòu)[圖1（a）、圖1（b）]。正常生育組10例標(biāo)本中，有2例可見脫落生精細(xì)胞，1例可見巨噬細(xì)胞，且在溶酶體內(nèi)ACP活性反應(yīng)弱。見表1。

2.2 凋亡精子與生精細(xì)胞的結(jié)構(gòu)

圖1 不育組凋亡生精細(xì)胞與ACP超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果

表1 正常生育組與不育組生精細(xì)胞ACP陽性反應(yīng)率的比較

在不育組10例標(biāo)本中，包括曾患過生殖系統(tǒng)慢性炎癥者3例、抗精抗體陽性者2例、精索靜脈曲張者1例、隱睪者1例，其凋亡精子及生精細(xì)胞比率分別為11%、15%、18%、20%，正常生育組和不育組標(biāo)本中，在一般超微結(jié)構(gòu)下精子表現(xiàn)為多種異常的形態(tài)，如尖頭、小頭、大頭、雙頭、頂體缺如、短尾、無尾等。且在不育組標(biāo)本中，凋亡生精細(xì)胞和精子在超微結(jié)構(gòu)下每例隨機(jī)觀察20個電鏡畫面均可見多種異常的形態(tài)。開始階段胞核濃縮，細(xì)胞核中電子密度增加，核膜間隙增寬，核下空泡形成，核膜膨脹折疊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張或消失，形成具有典型特征的髓鞘樣結(jié)構(gòu)[圖1（d）]，但中期精子尾部細(xì)胞器仍存在，部分微層9+2結(jié)構(gòu)仍清晰。最后核膜雙層裂解結(jié)構(gòu)消失，核內(nèi)高電子密度逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈碗娮用芏?，可出現(xiàn)凋亡小體及殘余體等結(jié)構(gòu)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，正常生育組與不育組間細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 正常生育組與不育組細(xì)胞凋亡率的比較

3 討論

近年來，由于環(huán)境因素及各種不明原因?qū)е碌哪行圆挥饾u增多。有研究結(jié)果顯示，生殖細(xì)胞內(nèi)酶特別是精液內(nèi)酶的檢測已成為判斷男性生育力強(qiáng)弱的一個重要指標(biāo)，精漿所含各種物質(zhì)對精子的存活、受精以及正常生理功能活動起著重要作用，精漿物理化學(xué)性質(zhì)的改變會對精子功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響，有研究發(fā)現(xiàn)精子活力減弱與精漿中ACP水平降低有關(guān)[8]。

另外，在精子發(fā)生過程中，各級生精細(xì)胞都會發(fā)生凋亡，是機(jī)體清除過量或異常生精細(xì)胞的一種重要方式。精子的成熟過程是諸多酶參與能量代謝的結(jié)果[9-10]。我們的前期研究結(jié)果表明，精漿中一氧化氮、精子頂體內(nèi)透明質(zhì)酸酶、精漿中α-1，4糖苷酶、人精子內(nèi)頂體蛋白酶、雙羰基-木酮糖還原酶均與男性不育存在密切關(guān)系[11-16]。但細(xì)胞內(nèi)ACP水平升高對精子凋亡及精子活力強(qiáng)弱影響少見報道。上述各種酶與精液內(nèi)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性有待研究。

本研究的10例不育組標(biāo)本，包括曾患過生殖系統(tǒng)慢性炎癥者3例、抗精抗體陽性者2例、精索靜脈曲張者1例、隱睪者1例，其凋亡精子及生精細(xì)胞比率分別為11%、15%、18%、20%，以上結(jié)果說明生殖系統(tǒng)的損傷對睪丸的影響程度與精子凋亡頻率關(guān)系密切。酶組化電鏡觀察結(jié)構(gòu)顯示，與不育組比較，正常生育組僅1例標(biāo)本見到生精細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。不育組可見大量脫落的生精上皮及巨噬細(xì)胞，溶酶體ACP陽性反應(yīng)率明顯增強(qiáng)，有大量的ACP活性的鉛沉淀，甚至在ACP活性很高的巨噬細(xì)胞內(nèi)可見大量被吞噬的凋亡精子及生精細(xì)胞。

本研究結(jié)果表明，在正常生育組與不育組精液標(biāo)本中，均存在一定量的ACP活性改變和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。不育組ACP陽性反應(yīng)率及細(xì)胞凋亡率均較正常對照組升高，其機(jī)制可能為ACP具有清除損傷和變異物質(zhì)的作用，ACP陽性反應(yīng)率升高可加快細(xì)胞凋亡速率。

綜上所述，細(xì)胞凋亡是多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多機(jī)制綜合參與的結(jié)果。生精細(xì)胞凋亡和酶學(xué)的改變可能是導(dǎo)致男性不育的重要機(jī)制，酶組化電鏡的應(yīng)用有望成為男性不育癥診治的新手段之一。

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