劉 暢，孔令鈺，李 楠，楊 萍

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

我國有數(shù)量龐大的糖尿病人群，隨之而來的降糖產(chǎn)品需求量也很大[1]。除化學(xué)合成口服降糖藥外，普通糖尿病人對中藥和保健品也很信賴。因此，假藥生產(chǎn)商在其中非法添加化學(xué)合成降糖藥物，使其療效顯著以牟取利益[2-6]。格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、二甲雙胍、苯乙雙胍因療效確切、價格低廉被廣泛應(yīng)用其中。而現(xiàn)在對降糖中藥和保健品中非法添加藥物的檢驗主要應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用的方法，雖然其專屬高效，但因為儀器設(shè)備的限制，基層藥檢部門需要更加適用的方法，本文建立更簡單、常規(guī)、普及的高效液相色譜法，可供基層食品藥品檢驗機(jī)構(gòu)檢驗檢查，有效打擊制假行為。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀；METTLER AE240電子天平。

1.2試藥 格列美脲(批號100674-201503)、格列吡嗪(批號100281-201604)、格列本脲(批號100135-201105)、鹽酸吡格列酮(批號100634-201202)、瑞格列奈(批號100753-201303)、格列齊特(批號100269-201505)、格列喹酮(批號100280-201403)、鹽酸二甲雙胍(批號100664-201604)、鹽酸苯乙雙胍(批號100922-201001)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇(DIKMA)為色譜純；其他試劑均為分析純；試驗用樣品膠囊A、膠囊B、膠囊C均于藥店及網(wǎng)上購買。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件1(適用于格列類及其他) 色譜柱：TIANHE Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0±0.05)(70∶30)；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：233 nm；進(jìn)樣量10 μl。以色譜峰的保留時間定性，并以紫外吸收光譜圖輔助定性，以外標(biāo)法峰面積定量。

2.2色譜條件2 (適用于雙胍類) 色譜柱：TIANHE Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-離子對試液(辛烷磺酸鈉0.585 6 g，加三乙胺1.4 ml，加水至1 000 ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5±0．05)(55∶45)；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：233 nm；進(jìn)樣量10 μl。以色譜峰的保留時間定性，并以紫外吸收光譜圖輔助定性，以外標(biāo)法峰面積定量。

2.3溶液的制備

2.3.1對照品溶液的制備 分別精密稱取格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮適量于同一量瓶中，甲醇定容得到格列類及其他對照品儲備液，再取1 ml該儲備液，用甲醇稀釋至10 ml，得到格列類及其他對照品溶液，濃度分別為20.64、39.88、30.09、59.43、21.73、80.69和69.57 μg/ml。分別精密稱取鹽酸二甲雙胍及鹽酸苯乙雙胍適量于同一量瓶中，甲醇定容得到雙胍類對照品儲備液，再取1 ml該儲備液，用甲醇稀釋至10 ml，得到雙胍類對照品溶液，濃度為40.29 及21.52 μg/ml。

2.3.2供試品溶液的制備 取膠囊20粒，去殼，研細(xì)，將殼剪碎，內(nèi)容物粉末和殼分別精密稱取0.5 g，置25 ml量瓶中，加適量甲醇，超聲處理20 min，冷卻至室溫，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4系統(tǒng)適用性試驗 取格列類及其他對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，其色譜峰流出順序依次為鹽酸吡格列酮(4.472 min)、格列吡嗪(5.907 min)、格列齊特(7.200 min)、格列本脲(12.367 min)、格列美脲(16.549 min)、瑞格列奈(18.835 min)、格列喹酮(27.598 min)，各降糖藥相鄰色譜峰分離度均大于1.5且峰對稱性較好，見圖1。取雙胍類對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件分析，其色譜峰流出順序依次為鹽酸二甲雙胍(3.828 min)、鹽酸苯乙雙胍(6.252 min)，兩種降糖藥色譜峰分離度大于1.5且峰對稱性較好，見圖2。

1.鹽酸吡格列酮 2.格列吡嗪 3.格列齊特

1.鹽酸二甲雙胍 2.鹽酸苯乙雙胍

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 在選定的色譜條件下，取兩種對照品儲備液加甲醇稀釋成6個水平的系列對照品工作溶液進(jìn)行分析。以峰面積和質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)在0.999 4～0.999 9之間，表明各化合物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見表1。

2.6檢出限和定量限試驗 以對照品溶液逐步稀釋至峰高為信噪比3倍時，格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍檢出限分別為0.72、0.40、0.75、0.59、0.65、0.48、0.83、0.32和0.86 μg/ml；至峰高為信噪比10倍時，格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍定量限分別為2.0、1.2、2.0、1.7、1.7、1.6、2.4、1.2和2.6 μg/ml。

2.7精密度試驗 取對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，測得峰面積。結(jié)果格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍和鹽酸苯乙雙胍峰面積的RSD分別為1.20%、0.67%、1.39%、1.03%、1.00%、1.70%、1.61%、0.44%和1.87%，表明精密度較好。

表1 各降糖藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.8重復(fù)性試驗 取確定不含上述化學(xué)合成降糖藥的保健品(膠囊A)，加入稀釋后的對照品儲備液，按照“2.3.2”項下方法對其進(jìn)行處理，并按“2.1”和“2.2”項下色譜條件測定峰面積，重復(fù)5次，格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍含量的RSD分別為2.30%、0.31%、1.63%、2.14%、1.88%、2.21%、2.07%、1.16%和2.67%，表明方法的重復(fù)性較好。

2.9穩(wěn)定性試驗 取“2.8”項下制備的樣品，在放置不同時間段(0、2、4、8、12和24 h)進(jìn)樣測定，結(jié)果格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍和鹽酸苯乙雙胍峰面積的RSD分別為1.86%、1.02%、0.97%、1.66%、0.76%、1.77%、1.78%、0.69%和0.83%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10回收率試驗 分別精密吸取兩種對照品儲備液1、2和3 ml各3份置25 ml量瓶中，再精密加入確定不含上述化學(xué)合成降糖藥的中藥保健品(膠囊A粉末)0.5 g，加適量甲醇，超聲處理20 min，冷卻至室溫，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，測定試驗回收率。結(jié)果格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍平均回收率分別為100.8%、102.0%、99.7%、101.7%、104.3%、101.2%、98.8%、100.0%和99.5%；RSD分別為1.44%、1.17%、1.95%、1.18%、1.82%、1.05%、1.84%、1.06%和1.96%。見表2-10。

表2 格列美脲回收率試驗結(jié)果

表3 格列吡嗪回收率試驗結(jié)果

表4 格列本脲回收率試驗結(jié)果

表5 鹽酸吡格列酮回收率試驗結(jié)果

表6 瑞格列奈回收率試驗結(jié)果

表7 格列齊特回收率試驗結(jié)果

表8 格列喹酮回收率試驗結(jié)果

表9 鹽酸二甲雙胍回收率試驗結(jié)果

表10 鹽酸苯乙雙胍回收率試驗結(jié)果

2.11樣品測定 運(yùn)用本文建立的方法對膠囊A、膠囊B、膠囊C三種保健品進(jìn)行測定，結(jié)果表明膠囊C粉末中含有一個保留時間為12.472的峰，與保留時間為12.367的格列本脲對照品一致，其紫外吸收也一致，初步確定該樣品中含有格列本脲，含量為1.28 mg/g，其他膠囊粉末和膠囊殼中均未檢出上述化學(xué)降糖藥物。色譜圖見圖3-圖4。

1.格列本脲

圖4 格列本脲(A)及膠囊C粉末(B)的紫外光譜圖

3 討論

3.1雙胍類藥物具有較強(qiáng)極性，使用常規(guī)流動相沖洗，柱保留時間短，加入辛烷磺酸鈉作為離子對試劑，柱有很好的保留，而這種條件下格列類的化合物難以分離，因此建立了兩種HPLC條件。

3.2為了簡化試驗步驟并保證較高的提取效率，本文采用超聲的方式來對樣品進(jìn)行提取?；瘜W(xué)降糖藥物在甲醇中均有良好的溶解性，故選擇甲醇作為溶劑。

3.3使用化學(xué)合成藥物過量時會有不同程度的不良反應(yīng)，抗糖尿病藥物的不良反應(yīng)主要有代謝和營養(yǎng)障礙，神經(jīng)系統(tǒng)損害和胃腸系統(tǒng)的損害，磺酰脲類降糖藥的不良反應(yīng)體現(xiàn)為胃腸道反應(yīng)、低血糖、過敏反應(yīng)、血液系統(tǒng)反應(yīng)、肝損傷、腎損傷等[7，8]。本試驗中，初步判斷一種保健品中含有化學(xué)合成藥。在保健品中添加化學(xué)合成藥物，普通消費者會在平時長期服用該保健品過程中用藥過量，出現(xiàn)不良反應(yīng)而不自知，或在服用過程中與某些藥物聯(lián)用，可能出現(xiàn)藥物的相互作用，對身體造成較大傷害。

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4 勵炯,曹青文,王姣斐,等.基于實心核顆粒色譜技術(shù)結(jié)合HPLC法快速測定保健食品中非法添加13種降糖化學(xué)成分[J].中草藥,2017,48(13):2666-2673

5 王巍,毛慶.中成藥和保健食品中非法添加化學(xué)物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].廣東化工,2016,43(22):120-121

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7 王蘭蘭.抗糖尿病藥物所致臨床不良反應(yīng)的臨床分析[J].糖尿病新世界,2015,18(2):5-6

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