任敏 李東霞 楊凌 蘇秀蘭

010050呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科（任敏、李東霞），臨床醫(yī)學(xué)研究中心（楊凌、蘇秀蘭）

小檗堿為天然中藥黃連所提取的生物堿，對皮膚鱗癌［1?2］、乳腺癌［3?4］、肝癌［5］、結(jié)腸癌［6］和神經(jīng)膠質(zhì)瘤［7］等惡性腫瘤具有一定的抗腫瘤活性，主要通過抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制轉(zhuǎn)移與侵襲而發(fā)揮作用。但對黑素瘤細胞周期阻滯作用的研究極少。我們前期研究證實［8］，小檗堿可抑制人黑素瘤細胞A375細胞增殖，并阻滯細胞于S期和G2/M期。細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDK）對細胞周期調(diào)控發(fā)揮重要作用。根據(jù)前期研究、相關(guān)文獻及miRNA數(shù)據(jù)庫（miRBase、Targetscan human7.1等），我們選擇miRNA?582?5p及其靶基因CDK1，miRNA?188?5p及其靶基因 CDK2、Cyclin D1、Cyclin A 為研究對象［9?10］，通過測定CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A及調(diào)節(jié)其表達的miRNA，探討小檗堿對黑素瘤A375細胞周期的影響機制。

一、材料與方法

1.細胞株及主要試劑和儀器：人皮膚黑素瘤A375細胞株（中國科學(xué)院上海細胞庫）。小檗堿（B325?5G）、二甲基亞砜（DMSO）、Trizol試劑（美國 Sigma公司）；胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）、胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；鼠抗人CDK1、Cyclin A單克隆抗體、兔抗人CDK2單克隆抗體（美國Abcam公司）；Cyclin D1兔抗人單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；熒光二抗（美國Invitrogen公司）；PCR擴增儀7500（美國ABI公司）；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LICOR公司）。

2.A375細胞培養(yǎng)及實驗分組：用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)A375細胞。取對數(shù)生長期細胞，以1.0×105個/ml接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2 ml。培養(yǎng)單層細胞融合度達70%時，分為實驗組和空白對照組進行實驗，每組設(shè)3個復(fù)孔。實驗組小檗堿濃度分別為 20、40、60、80 μmol/L，空白對照組加等量 DMSO，兩組DMSO濃度相等（0.2%），于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。

3.實時定量RT?PCR檢測miRNA?582?5p、miRNA?188?5p及CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A mRNA的表達：收集0、20、40、60、80 μmol/L 小檗堿作用 48 h后的細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA濃度及純度，測定A260/A280值在1.8～2.0，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，總反應(yīng)體系為20 μl（PrimeScrip RT Master Mix 9 μl，總RNA與無核糖核酸酶水共11 μl），反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃終止反應(yīng)，產(chǎn)物置-80℃冰箱待用。實時定量RT?PCR擴增miRNA?582?5p、miRNA?188?5p、CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A mRNA和內(nèi)參3?磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、U6，引物序列見表1。G?R為miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒中提供的通用引物，序列為 5′?GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATT?3′，退火溫度為68.5℃。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明制備PCR反應(yīng)體系20 μl。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；變性95℃15 s，退火1 min（各引物退火溫度見表1），延伸72℃30 s，共40個循環(huán)；延伸72℃7 min，4℃終止。計算目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值△Ct，以空白組為對照組，計算各試驗組目的基因mRNA或miRNA相對表達量（2?△△Ct）進行比較。

4.Western印跡檢測CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A蛋白水平：將A375細胞分別與0、20、40、60、80 μmol/L小檗堿培養(yǎng)基2 ml作用48 h，提取蛋白，凝膠電泳后將電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜（NC膜）上。以含5%脫脂奶粉的TBST（含Tris?Hcl，Nacl，Tween20）緩沖液室溫封閉1 h。一抗（CDK1抗體、CDK2抗體、Cyclin D1抗體、Cyclin A抗體）4℃孵育過夜。繼以二抗室溫孵育1 h，在暗室內(nèi)將膜取出，采用Odyssey成像儀成像，Image Studio Lite Ver 3.1圖像分析軟件分析目的蛋白灰度值，以β肌動蛋白的灰度值為內(nèi)參，計算CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

5.統(tǒng)計學(xué)分析：用SPSS17.0軟件，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.A375細胞中miRNA?582?5p、miRNA?188?5p及對應(yīng)靶基因CDK1、Cyclin A、Cyclin D1、CDK2 mRNA含量：與空白對照組相比，20、40 μmol/L小檗堿組miRNA?582?5p的表達無明顯變化，60、80 μmol/L組miRNA?582?5p的表達上調(diào)。隨著小檗堿濃度的增加，實驗組miRNA?188?5p表達增強，CDK2、CDK1、Cyclin A、Cyclin D1mRNA 表達逐漸減弱。見表2。

表1 miRNA及細胞周期相關(guān)蛋白基因引物序列

表2 不同濃度小檗堿作用A375細胞后各miRNA和對應(yīng)靶基因mRNA相對表達水平（2?ΔΔCt，±s）

表2 不同濃度小檗堿作用A375細胞后各miRNA和對應(yīng)靶基因mRNA相對表達水平（2?ΔΔCt，±s）

注：n=3。a表示與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；b表示與相鄰低濃度組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CDK：細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶；Cyclin：細胞周期蛋白

組別空白對照組小檗堿組20 μmol/L 40 μmol/L 60 μmol/L 80 μmol/L F值P值miRNA?582?5p 1.000±0.000 miRNA?188?5p 1.000±0.000 CDK1 1.000±0.000 CDK2 1.000±0.000 Cyclin D1 1.000±0.000 Cyclin A 1.000±0.000 1.192±0.052 1.409±0.226 1.791±0.424a 1.925±0.153a 8.945 0.002 1.223±0.052a 1.275±0.121a 1.351±0.053a 1.521±0.062a b 22.600＜0.001 0.825±0.056a 0.636±0.076a b 0.240±0.010a b 0.087±0.004a b 248.510＜0.001 0.718±0.086a 0.596±0.094a b 0.507±0.048a 0.308±0.025a b 51.976＜0.001 0.580±0.036a 0.512±0.008a b 0.421±0.036a b 0.062±0.006a b 626.671＜0.001 0.682±0.068a 0.459±0.046a b 0.163±0.005a b 0.089±0.004a b 312.740＜0.001

2.小檗堿對 CDK1、Cyclin A、Cyclin D1、CDK2蛋白水平的影響：與空白對照組相比，20 ～ 80 μmol/L小檗堿組 CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A蛋白表達顯著降低。見表3。

表3 不同濃度小檗堿作用A375細胞后細胞周期相關(guān)蛋白相對表達水平（±s）

表3 不同濃度小檗堿作用A375細胞后細胞周期相關(guān)蛋白相對表達水平（±s）

注：n=3。a表示與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；b表示與相鄰低濃度組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CDK：細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶；Cyclin：細胞周期蛋白

組別空白對照組小檗堿組20 μmol/L 40 μmol/L 60 μmol/L 80 μmol/L F值P值CDK1 0.481±0.084 CDK2 0.601±0.072 Cyclin D1 0.552±0.035 Cyclin A 1.123±0.084 0.252±0.090a 0.009±0.020a b 0.033±0.004a 0.044±0.001a 138.124＜0.001 0.332±0.080a 0.339±0.060a 0.401±0.008a 0.134±0.009a b 110.966＜0.001 0.517±0.050 0.411±0.013a b 0.303±0.040a b 0.318±0.003a 278.772＜0.001 0.882±0.070a 0.719±0.070a b 0.677±0.030a 0.573±0.004a b 140.167＜0.001

三、討論

黑素瘤是一種具有高度侵襲性、轉(zhuǎn)移性和高致死率的惡性腫瘤。在黑素細胞向黑素瘤細胞轉(zhuǎn)變的過程中，細胞周期及凋亡等狀態(tài)改變在細胞異常增殖中起到關(guān)鍵作用。已發(fā)現(xiàn)細胞周期調(diào)控因子有三大類：Cyclin、CDK和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）。CDK為整個細胞分裂過程中調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，Cyclin與CKI則分別對其進行正性調(diào)控與負性調(diào)控，進而對細胞周期進程發(fā)揮促進與抑制作用［11］。本研究結(jié)果顯示，小檗堿作用A375細胞后細胞周期相關(guān)蛋白CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A表達均下調(diào)，提示小檗堿可通過降低細胞周期相關(guān)蛋白的表達對黑素瘤A375細胞周期發(fā)揮阻滯作用。

miRNA是一種長20～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA，通過對靶mRNA的降解或?qū)Π谢虻姆g抑制發(fā)揮作用。既往研究顯示，上調(diào)miRNA?582?5p的表達可以抑制肝癌細胞的增殖［9］，抑制結(jié)直腸癌細胞增殖與侵襲［12］，抑制膀胱癌和前列腺癌的生長與轉(zhuǎn)移［13?14］。本研究qRT?PCR結(jié)果顯示，隨著小檗堿濃度的增加，miRNA?188?5p表達增加；而小檗堿在20 μmol/L、40 μmol/L濃度下對miRNA?582?5p的表達無明顯影響，在60 μmol/L、80 μmol/L時miRNA?582?5p的表達上調(diào)。研究中發(fā)現(xiàn)miRNA變化水平與細胞周期相關(guān)mRNA、蛋白表達不完全一致，我們推測在影響CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A mRNA及蛋白的表達中有其他miRNA發(fā)揮重要作用。

綜上所述，小檗堿通過下調(diào)細胞周期相關(guān)CDK1、CDK2、Cyclin D1和Cyclin A mRNA的表達，上調(diào)抑制mRNA翻譯相關(guān)的miRNA?582?5p、miRNA?188?5p表達，進而降低相應(yīng)蛋白表達，發(fā)揮阻滯細胞周期的作用。

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