朱騰 晉紅中

100730北京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科

泛發(fā)性膿皰性銀屑?。╣eneralized pustular psoriasis，GPP）是一種系統(tǒng)性炎癥性皮膚病，臨床上通常以突發(fā)紅斑以及紅斑基礎上粟粒大小的無菌性膿皰為主要特點［1?2］。有研究表明，程序性細胞死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1）基因缺陷可促進γδT細胞及Th17細胞產(chǎn)生IL?17及IL?22，從而增加對中性粒細胞的招募，導致銀屑病樣皮炎的發(fā)生［3］。提示PDCD1及其相關(guān)受體通路可能與GPP的發(fā)生有關(guān)。本研究檢測PDCD1受體及下游NF?κB在GPP患者外周血單個核細胞（PBMC）中的表達量，并檢測GPP患者血清中下游白細胞介素17（IL?17）、IL?22及IL?4的含量。

一、對象

2015年5月至2016年11月就診于北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科的GPP患者。入選標準：18～75周歲，性別不限，經(jīng)臨床及組織病理確診為GPP，入組時處于膿皰發(fā)作期。排除標準：抽血前2個月內(nèi)曾系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、維A酸類、生物制劑及免疫抑制劑等藥物；伴有其他類型皮膚病、腫瘤、其他自身免疫病或其他嚴重疾患。入選GPP患者23例，女11例，男12例，平均年齡35.3歲。健康對照組24例選自北京協(xié)和醫(yī)院體檢中心，女12例，男12例，平均年齡38.1歲。兩組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究通過北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

二、方法

1.標本：采集23例GPP患者及24例健康對照者外周血，分離血清及使用密度梯度離心法提取PBMC。

2.RT?PCR檢測PBMC中PDCD1及其配體（PD?L1和PD?L2）和NF?κB mRNA的表達：Trizol法提取PBMC中總RNA，實驗過程中僅從9例GPP患者及10例健康對照者成功提取RNA，患者組（9例）和對照組（10例）間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進行擴增。PCR反應體系10 μl，反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每升高1℃采集5次熒光信號。以β肌動蛋白為內(nèi)參基因，使用2?△△Ct法計算mRNA的相對表達量。

3.血清中 IL?17、IL?22及IL?4含量檢測：使用美國quanticyto公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測23例GPP患者以及24例健康對照者血清中的IL?4、IL?17、IL?22。

4.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

三、結(jié)果

1.PBMC中PDCD1、PD?L1、PD?L2及NF?κB mRNA表達水平：GPP患者組PDCD1 mRNA的相對表達量低于對照組，PD?L1、PD?L2 mRNA均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組NF?κB mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

2.血清中IL?4、IL?17及IL?22表達水平：患者組IL?4、IL?17、IL?22表達量均高于對照組，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見表3。

表1 程序性細胞死亡受體1（PDCD1）及配體（PD?L1、PD?L2）、NF?κB基因引物序列

表2 泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者外周血單個核細胞中程序性細胞死亡受體1（PDCD1）及配體（PD?L1和PD?L2）以及NF?κB mRNA相對表達量（±s）

表2 泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者外周血單個核細胞中程序性細胞死亡受體1（PDCD1）及配體（PD?L1和PD?L2）以及NF?κB mRNA相對表達量（±s）

組別患者組對照組t值P值例數(shù)9 10 PDCD1 3.13±4.62 23.70±15.33 3.40＜0.05 PD?L1（× 10?4）5.70±3.07 2.00±1.98 2.96＜0.05 PD?L2（× 10?4）0.95±0.71 0.16±0.20 3.38＜0.05 NF?κB（× 10?3）1.90±0.82 1.50±0.91 0.75＞0.05

表3 泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者外周血單個核細胞中白細胞介素4（IL?4）、IL?17及IL?22表達水平（± s）

表3 泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者外周血單個核細胞中白細胞介素4（IL?4）、IL?17及IL?22表達水平（± s）

組別患者組對照組t值P值例數(shù)23 24 IL?4 99.46±74.74 17.34±47.87 4.46＜0.001 IL?17 304.19±280.66 62.38±84.03 3.96＜0.001 IL?22 338.37±245.44 28.10±84.88 5.74＜0.001

四、討論

PDCD1是通過減數(shù)雜交技術(shù)從小鼠T淋巴細胞雜交瘤細胞克隆而成，其胞質(zhì)區(qū)域N端含有一個免疫受體酪氨酸抑制基序，C端為一個免疫受體酪氨酸活化基序，與胞內(nèi)細胞傳導有關(guān)［4］。有研究表明，PDCD1分子的基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡［5］、多發(fā)性硬化［6］發(fā)病相關(guān)，但尚無PDCD1 與GPP的研究。

PDCD1及其配體結(jié)合后的抑制途徑在T細胞反應的各個階段都發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用［7］，若阻斷PDCD1及其配體途徑，T細胞將缺失有效的負性調(diào)節(jié)信號，從而導致免疫性疾病的發(fā)生。PD?L1與PD?L2均可表達于T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞及樹突細胞表面，并且隨著這些細胞的活化而上調(diào)［8］。本研究結(jié)果顯示，GPP患者與健康對照者比較，PBMC中PDCD1 mRNA表達降低，PD?L1、PD?L2 mRNA表達升高?？赡苁怯捎贕PP患者PBMC中PDCD1基因的表達量明顯下調(diào)，PDCD1的負性調(diào)控信號減弱，下游信號通路的NF?κB等分子過度激活，從而導致T淋巴細胞、B淋巴細胞及單核細胞等過度活化，產(chǎn)生大量的炎癥因子。也有研究表明，PD?L1及PD?L2高表達的淋巴細胞可以誘導PDCD1的表達［9］，因此，PD?L1及PD?L2的上調(diào)也可能是機體對PDCD1的表達量下調(diào)的負反饋調(diào)節(jié)。

有研究證實，PDCD1基因缺陷能夠誘發(fā)小鼠銀屑病樣皮炎［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，GPP患者外周血血清中IL?4、IL?17及IL?22濃度顯著增加。這可能與PDCD1基因缺失后失去抑制γδT細胞及Th17細胞產(chǎn)生IL?17及IL?22的能力，使得IL?17及IL?22的水平明顯增高，從而極大地增加了對中性粒細胞的招募而導致銀屑病樣皮炎的發(fā)生，同時IL?4水平增高可進一步上調(diào)PD?L2表達。而在GPP患者的皮損組織病理中常見表皮海綿狀膿皰，位于棘細胞上層（Kogoj海綿狀膿皰）和角質(zhì)層中（Munro微膿瘍）。這提示PDCD1的缺失可能導致炎癥通路的過度激活，從而導致或加劇GPP的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，PDCD1及其配體在GPP患者PBMC中表達異常，但是否可以通過制備PDCD1功能性蛋白、增強PDCD1的負性信號對GPP進行靶向治療有待進一步研究。

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