陳向齊 林兵 劉志宏 昊霞 宋洪濤 陳勝平

350025福州，廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院 解放軍福州總醫(yī)院皮膚科（陳向齊、陳勝平），藥學(xué)科（林兵、劉志宏、昊霞、宋洪濤）

光動(dòng)力學(xué)療法用于治療痤瘡療效顯著，副作用小，已成為目前的研究熱點(diǎn)。氨基酮戊酸（ALA）經(jīng)上皮細(xì)胞及毛囊皮脂腺吸收后，可以通過(guò)血紅素合成途徑代謝為原卟啉Ⅸ，當(dāng)光線照射時(shí)，PpIX受激發(fā)產(chǎn)生單態(tài)氧和自由基，使得細(xì)胞凋亡，皮脂腺萎縮，痤瘡丙酸桿菌被殺滅。Toll樣受體（Toll?like receptor，TLR）在細(xì)胞表面以模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRR）方式識(shí)別細(xì)菌脂多糖、脂蛋白和鞭毛蛋白等分子。通過(guò)髓樣分化因子88（MyD88）依賴和非依賴途徑，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)如細(xì)胞因子、一氧化氮或干擾素產(chǎn)生［1］。但痤瘡丙酸桿菌細(xì)胞壁表面肽聚糖能否被細(xì)胞膜上TLR2受體識(shí)別，并通過(guò)MyD88依賴的和非依賴的途徑產(chǎn)生細(xì)胞因子，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討氨基酮戊酸光動(dòng)力療法（ALA?PDT）免疫調(diào)控作用機(jī)制，為闡述TLR2在痤瘡天然免疫和獲得性免疫中的作用提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、試劑

含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7（上海細(xì)胞生物研究所），痤瘡丙酸桿菌（ATCC6919）（廣東省微生物研究所），厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司），ALA（上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司），腫瘤壞死因子α（TNF?α）、白細(xì)胞介素6（IL?6）試劑盒（上海西塘生物技術(shù)有限公司）?？筎LR2抗體（ab?16894）、抗MyD88抗體（ab?2068）、抗p38抗體（ab?31828）、抗p?p38抗體（ab?207483）、抗JNK抗體（ab?176662）、抗p?JNK抗體（ab?207477）、抗ERK抗體（ab?54230）、抗p?ERK抗體（ab?214362）、抗IκBα抗體（ab?5076）、抗p?IκBα抗體（ab?209942）［艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱環(huán)境下，將小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7接種于培養(yǎng)皿中，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。隔日更換培養(yǎng)基，2～3 d傳代1次，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.滅活細(xì)菌液的準(zhǔn)備：挑取單個(gè)痤瘡丙酸桿菌菌落接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，在37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)3 d，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ?jì)數(shù)，以生理氯化鈉溶液調(diào)配細(xì)菌至1×108細(xì)胞/ml，95℃水滅活15 min。

3.實(shí)驗(yàn)分組：①空白組為單純RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)；②模型組：按文獻(xiàn)［2］，給予終濃度2.25×107個(gè)/ml痤瘡丙酸桿菌滅活液刺激RAW264.7細(xì)胞（2.25×105個(gè)/ml）2 h；③0.03 mmol/L ALA組；④0.06 mmol/L ALA組；⑤0.12 mmol/L ALA組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。預(yù)實(shí)驗(yàn)有單獨(dú)照光組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示和空白組一樣，認(rèn)為單獨(dú)照光對(duì)細(xì)胞無(wú)影響（數(shù)據(jù)未顯示），故正式實(shí)驗(yàn)不設(shè)單獨(dú)照光組。

4.酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)TNF?α和IL?6濃度：RAW264.7細(xì)胞以2.25×105個(gè)/ml接種于黑色6孔板（2 ml），置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。除空白組外，其他組給終濃度2.25×107個(gè)/ml細(xì)菌滅活液（感染復(fù)數(shù)MOI=100∶1）刺激2 h。ALA終濃度分別為0.03、0.06、0.12 mmol/L，空白組和模型組加等量的PBS液。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。給予16 J/cm2紅光照射。換1 ml新培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 h后取出，收集上清液。按ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)TNF?α和IL?6含量。

5.Western印跡法檢測(cè)ALA對(duì)TLR2、MyD88、p38、JNK、ERK、IκBα表達(dá)的影響：細(xì)胞培養(yǎng)同上。棄去培養(yǎng)上清液，細(xì)胞用PBS液洗滌2次，每孔加入100 μl細(xì)胞裂解液，放置5 min，在8 780g下離心15 ～30 min，去上清液，4℃冷卻。蛋白定量后，每組分別取20 μg總蛋白，經(jīng)10%SDS?PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜和4℃封閉過(guò)夜，用牛血清白蛋白（BSA）封閉磷酸化抗體。再分別和相應(yīng)的一抗4℃孵育、過(guò)夜。洗膜后分別與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描。

6.統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，各組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，方差齊同時(shí)用LSD法，方差不齊時(shí)用Tambane′s T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ALA?PDT對(duì)痤瘡丙酸桿菌刺激RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

1.TNF?α：和空白組比較，模型組TNF?α濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明炎癥模型造模成功。和0.03 mmol/L ALA組、0.12 mmol/L ALA組比較，模型組TNF?α濃度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。0.12 mmol/L ALA組和空白組、模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；0.12 mmol/L ALA組和0.03 mmol/L ALA組比較，采用單因素方差分析，P=0.440，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明在0～0.12 mmol/L ALA濃度區(qū)間內(nèi)，TNF?α和ALA濃度無(wú)劑量依賴性（表1）。

2.IL?6：和其他組相比，模型組濃度升高（P＜0.05），各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=114.813，P=0.001）。表明在0～ 0.12 mmol/L ALA濃度區(qū)間內(nèi)，隨ALA濃度升高，IL?6濃度降低，呈劑量依賴性（表1）。

二、ALA?PDT對(duì)TLR2、MyD88蛋白表達(dá)的影響

模型組TLR2和空白組、0.12 mmol/L ALA組比較、0.06 mmol/L ALA組和空白組比較，P=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.12和0.03 mmol/L ALA組比較，P=0.011，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組MyD88和空白組比較、0.06 mmol/L ALA組和空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.12和0.03 mmol/L ALA組比較，均P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明在0～0.12 mmol/L ALA濃度區(qū)間內(nèi)，隨ALA濃度升高，TLR2、MyD88表達(dá)降低，呈劑量依賴性（表2，圖1）。

相關(guān)性分析顯示，TLR2蛋白濃度和上清液中TNF?α（r=0.73，P＜ 0.01）、IL?6濃度（r=0.92，P＜0.01）存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

表1 氨基酮戊酸（ALA）光動(dòng)力療法對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子（TNF）α、白細(xì)胞介素（IL）6的影響（±s）

表1 氨基酮戊酸（ALA）光動(dòng)力療法對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子（TNF）α、白細(xì)胞介素（IL）6的影響（±s）

注：n=3。a和空白組、0.03 mmol/L ALA組、0.12 mmol/L ALA組比較，均P＜0.01；b和模型組比較，P ＜0.01；c和0.03 mmol/L ALA組比較，P ＞0.05；d和空白組、0.03 mmol/L ALA組、0.12 mmol/L ALA組比較，均P＜0.05；e和空白組、0.03 mmol/L ALA組比較，均P＜0.01

組別空白組模型組0.03 mmol/L ALA組0.06 mmol/L ALA組0.12 mmol/L ALA組F值P值TNF?α（ng/L）0.24±0.01 0.34±0.02a 0.04±0.01 0.03±0.01 0.03±0.01b c IL?6（ng/L）0.01±0.01 0.21±0.03d 0.09±0.01 0.08±0.01 0.07±0.01e 114.81＜0.01

表2 氨基酮戊酸（ALA）光動(dòng)力療法對(duì)RAW264.7細(xì)胞TLR2、MyD88蛋白的影響（±s，A值）

表2 氨基酮戊酸（ALA）光動(dòng)力療法對(duì)RAW264.7細(xì)胞TLR2、MyD88蛋白的影響（±s，A值）

注：n=3。a和空白組、0.12 mmol/L ALA組比較，均P ＜ 0.001；b和0.03 mmol/L ALA組比較，P＜0.05；c和空白組比較，P＜0.01；d和0.03 mmol/L ALA組比較，P＜0.05

組別空白組模型組0.03 mmol/L ALA組0.06 mmol/L ALA組0.12 mmol/L ALA組F值P值TLR2 0.38±0.05 0.90±0.14a 0.85±0.11 0.65±0.03 0.47±0.15b 117.62＜0.01 MyD88 0.20±0.03 1.11±0.13c 0.94±0.02 0.43±0.04 0.27±0.12d 103.21＜0.01

圖1 Western 印跡檢測(cè)TLR2、MyD88、p38、JNK、ERK、IκBα的表達(dá) 1：空白組；2：模型組；3：0.03 mmol/L ALA；4：0.06 mmol/L ALA；5：0.12 mmol/L ALA

三、ALA?PDT對(duì)p38、IκBα、JNK、ERK蛋白的表達(dá)及磷酸化的影響

模型組p38、IκBα、JNK、ERK蛋白表達(dá)和空白組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），隨著ALA濃度升高，以上蛋白表達(dá)均無(wú)變化。見(jiàn)表3，圖1。

表3 氨基酮戊酸（ALA）光動(dòng)力療法對(duì)痤瘡丙酸桿菌刺激RAW264.7細(xì)胞表達(dá)p38、IκBα、JNK、ERK蛋白及相應(yīng)的磷酸化蛋白的影響（±s，A值）

表3 氨基酮戊酸（ALA）光動(dòng)力療法對(duì)痤瘡丙酸桿菌刺激RAW264.7細(xì)胞表達(dá)p38、IκBα、JNK、ERK蛋白及相應(yīng)的磷酸化蛋白的影響（±s，A值）

注：n=4

組別空白組模型組0.03 mmol/L 0.06 mmol/L 0.12 mmol/L p38 0.48±0.05 0.46±0.22 0.47±0.06 0.48±0.18 0.49±0.11 IκBα 0.39±0.03 0.39±0.06 0.40±0.02 0.41±0.11 0.40±0.12 JNK 0.91±0.23 0.89±0.32 0.93±0.18 0.93±0.21 0.78±0.05 ERK 0.59±0.06 0.57±0.25 0.57±0.11 0.61±0.15 0.62±0.15 p?p38 0.15±0.01 0.84±0.04 0.75±0.01 0.31±0.02 0.21±0.02 p?IκBα 0.56±0.08 1.45±0.20 1.11±0.28 0.61±0.19 0.47±0.07 p?JNK 0.84±0.01 2.56±0.06 2.03±0.05 1.56±0.04 1.03±0.02 p?ERK 0.96±0.16 3.70±0.40 3.44±0.48 1.52±0.32 1.05±0.14

模型組p?p38、p?IκBα、p?JNK、p?ERK蛋白和空白組比較，表達(dá)升高，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著ALA濃度升高而p?p38、p?IκBα、p?JNK、p?ERK蛋白表達(dá)降低，呈劑量依賴性（表3，圖1）。

討 論

痤瘡丙酸桿菌肽聚糖包含兩個(gè)甘氨酸殘基結(jié)合的氨基和羧基功能團(tuán)形態(tài)肽鏈的交聯(lián)區(qū)域，允許免疫細(xì)胞通過(guò) PRP識(shí)別［2］。Mochizuki等［3］研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)明顯增高，從而激活巨噬細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子IL?8、TNF?α。本研究結(jié)果表明，用痤瘡丙酸桿菌滅活液感染RAW264.7細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL?6和TNF?α升高。隨著ALA濃度升高，IL?6水平隨著降低，呈劑量依賴性。而TNF?α的水平比模型組有所下降，無(wú)劑量依賴性。表明ALA?PDT治療能減少TNF?α和IL?6的分泌，從而減輕炎癥。

NF?κB 抑制劑（BAY11?7802）、ERK 抑制劑（PD98059）、p38抑制劑（SB203580）和JNK抑制劑（SP600125）能夠以劑量依賴方式減少核梭桿菌感染的骨髓巨噬細(xì)胞分泌IL?6和TNF?α。有意義的是，NF?κB和p38抑制劑能夠抑制放線桿菌感染的巨噬細(xì)胞分泌IL?6和TNF?α，而ERK和JNK抑制劑則不能［4］。這些結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞可通過(guò)NF?κB和MAPKs信號(hào)途徑直接產(chǎn)生細(xì)胞因子。本文結(jié)果表明，用痤瘡丙酸桿菌刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞后 TLR2、MyD88、p?p38、p?IκBα、p?JNK、p?ERK均表達(dá)升高，給予不同濃度5?ALA?PDT治療后表達(dá)降低，隨著濃度升高，TLR2、MyD88、p?p38、p?IκBα、p?JNK、p?ERK表達(dá)下降，呈劑量依賴性，TLR2蛋白表達(dá)和上清液中TNF?α、IL?2的濃度呈正相關(guān)。

p38是MAPK家族的重要成員。我們的研究發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF?α、IL?6顯著增高，TLR2蛋白的表達(dá)和上清液中TNF?α、IL?6的濃度呈正相關(guān)，提示TLR2參與了痤瘡的炎癥反應(yīng)?？赡艿臋C(jī)制是巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜上TLR2識(shí)別痤瘡丙桿菌細(xì)胞壁上的肽聚糖，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞經(jīng)NF?кB通路活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，合成IL?6、TNF?α和其他細(xì)胞因子，釋放到細(xì)胞外，引起炎癥反應(yīng)。

綜上所述，痤瘡丙酸桿菌滅活液可以增加小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性和TLR2的表達(dá)，通過(guò)依賴MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細(xì)胞因子分泌增加。ALA?PDT可減少TLR2的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細(xì)胞因子分泌減少，以上發(fā)現(xiàn)為ALA?PDT治療痤瘡提供了新的思路，可能有助于治療尋常痤瘡新藥物的研發(fā)。

［1］Kawai T,Akira S.The role of pattern?recognition receptors in innate immunity:update on Toll?like receptors［J］.Nat Immunol,2010,11（5）:373?384.doi:10.1038/ni.1863.

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