吳 丹，蔣華北,2*

(1.電子科技大學(xué)電子科學(xué)與工程學(xué)院， 四川 成都 610054； 2.南佛羅里達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程系， 美國 佛羅里達(dá)州 33620)

0 引言

光聲層析成像技術(shù)(photoacoustic tomography，pAT)這種無損成像模式最近十幾年一直迅速發(fā)展，其以信息檢測(cè)為依據(jù)，是一種根據(jù)生物組織內(nèi)部的光學(xué)吸收差異，通過探測(cè)超聲信號(hào)來獲取光聲信息的生物醫(yī)學(xué)光子成像方法，這種結(jié)構(gòu)與功能醫(yī)學(xué)成像技術(shù)非常具有發(fā)展前景[1-5]。pAT技術(shù)可借助外源造影劑來增加被測(cè)物體與周圍背景組織間的成像對(duì)比度，也可提高成像深度以及成像分辨率，同時(shí)外源造影劑可以增強(qiáng)系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度，幫助定位識(shí)別特定的組織[6-10]。

貴金屬納米顆?，F(xiàn)已被廣泛用作光聲成像造影劑，其由于表面等離子體共振效應(yīng)，對(duì)于特定的光有很強(qiáng)的吸收。貴金屬納米顆粒不但具有優(yōu)越的光學(xué)特性，且具有成熟的制備工藝和優(yōu)異的表面結(jié)合特性，在光學(xué)與生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用很廣[11-13]。貴金屬納米粒子的線性光學(xué)特性(消光，吸收與散射)受粒子尺寸、形狀、材料及周圍介質(zhì)介電特性等因素的強(qiáng)烈影響[11,13]。一般的貴金屬納米顆粒對(duì)光的吸收比傳統(tǒng)的染色分子對(duì)光的吸收要大幾個(gè)數(shù)量級(jí)[13]。此外，貴金屬納米顆粒表面還可以進(jìn)行聚乙二醇(pEG)修飾，這樣可以增強(qiáng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，減少其細(xì)胞毒性，并且可以是納米顆粒更加穩(wěn)定，減少其聚合[11,13]。目前有很多貴金屬納米顆粒作為光聲成像造影劑，主要有兩種材料，金和銀。金納米球型顆粒(Au nanoparticles)的吸收峰一般集中在520-550 nm可見光譜范圍內(nèi)，其直徑在20-80 nm范圍內(nèi)變化，其吸收波長(zhǎng)顆粒直徑的增加而增加[13]，它很適合被用于做光聲活體實(shí)驗(yàn)。

針灸中針法是指在傳統(tǒng)中醫(yī)理論的指導(dǎo)下把針具(通常指毫針)按照一定的角度刺入患者體內(nèi)，運(yùn)用捻轉(zhuǎn)與提插等針刺手法來對(duì)其特定部位(穴位)進(jìn)行刺激從而達(dá)到治療疾病的目的。穴位，學(xué)名腧穴，指人體經(jīng)絡(luò)線上特殊的點(diǎn)區(qū)部位[14,15]。大量研究表明，針灸穴位對(duì)人和動(dòng)物的調(diào)節(jié)作用，與刺激神經(jīng)系統(tǒng)的作用和調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。針刺可以對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)包括腦干，下丘腦，基底節(jié)和大腦皮層產(chǎn)生不同的影響[14]。我們之前的光聲成像研究表明，針刺涌泉穴(KI01)和陽陵泉穴(GB34)可以無創(chuàng)地增加活體小鼠大腦皮層血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)[腦血流(cerebral blood flow，CBF)、血紅蛋白(total hemoglobin，HbT)濃度][16,17]。

在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)展了一種基于針灸輔助造影劑的方法。此方法中，靜脈注射pEG-Au納米顆粒溶液作為成像造影劑，同時(shí)通過結(jié)合針刺小鼠陽陵泉穴位(GB34)來增加小鼠大腦皮層血紅蛋白濃度的方式，共同提高小鼠大腦皮層脈管系統(tǒng)的光聲響應(yīng)，提高大腦皮層血管與周圍背景組織間的成像對(duì)比度與成像分辨率。據(jù)我們了解，這是第一次同時(shí)利用上述兩種外源輔助方法來對(duì)小鼠大腦皮層脈管系統(tǒng)進(jìn)行清晰地高對(duì)比度的光聲層析成像。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究中使用22只體重在27 g至35 g之間的雄性健康無特定病原體動(dòng)物(specific pathogen free，SpF)癌癥研究所(institute of cancer research，ICR)小鼠。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都得到了學(xué)校動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有的小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中均利用濃度為10%的水合氯醛溶液施加麻醉，腹腔注射給藥劑量為4 mL/kg體重。利用一個(gè)恒溫系統(tǒng)來幫助維持小鼠體溫在(37±1)℃，這對(duì)于實(shí)驗(yàn)過程中降低小鼠死亡率是至關(guān)重要的。成像前，利用電推剪去除鼠頭部和右后肢的毛發(fā)，然后用脫毛膏進(jìn)行二次備皮。根據(jù)需要，位于右后肢的陽陵泉穴位用輕微的標(biāo)記點(diǎn)標(biāo)記。在成像期間，將小鼠放置在自制固定架子中，其頭部，尾部和四肢被限制活動(dòng)，在小鼠頭上涂抹超聲波耦合劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

本項(xiàng)研究工作，主要使用自主搭建的環(huán)形掃描pAT系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究(見圖1)。在使用532 nm脈沖Nd-YAG激光器(Brilliant b，Quantel)作為激發(fā)光源，脈沖持續(xù)時(shí)間為6-9 ns，最大脈沖功率為400 mJ，脈沖重復(fù)頻率為1.25 Hz。在這項(xiàng)工作中，動(dòng)物頭皮表面的脈沖光功率為10 mJ/cm2，在皮膚能承受的激光能量安全閾值之內(nèi)。固定小鼠的自制架子放在一個(gè)高度可調(diào)的升降臺(tái)上。激光出口下方放置一個(gè)水槽，底部中央有一個(gè)開口，利用用透明的聚乙烯薄膜密封。小鼠頭皮與薄膜間接接觸，為了最大化傳輸超聲波，中間涂有超聲耦合劑。激光束經(jīng)由凹透鏡擴(kuò)束，然后經(jīng)過毛玻璃均勻化。小鼠頭部在出射光照射后吸收光能，并產(chǎn)生光聲信號(hào)，利用一個(gè)放置在距離成像中心45 mm處的5 MHz中心頻率超聲換能器探測(cè)該光聲信號(hào)。通過步進(jìn)電機(jī)控制超聲換能器進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，超聲換能器以成像目標(biāo)為中心，2度為步長(zhǎng)進(jìn)行360度旋轉(zhuǎn)，因此在一個(gè)成像實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)180個(gè)探測(cè)位置的信號(hào)，單幅圖像采集時(shí)間大約2分24秒，最后利用延遲疊加重構(gòu)算法通過光聲信號(hào)重建出光聲腦圖像。

圖1 活體小鼠光聲層析成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Schematic of the home-made pAT system for in vivo mouse brain imaging

1.3 造影劑：金納米顆粒

在這項(xiàng)研究中，我們使用pEG-Au納米顆粒作為活體大腦光聲成像的造影劑。pEG-Au納米顆粒由成都盛泰爾生物醫(yī)藥科技有限公司合成。金納米顆粒的平均粒徑為40 nm，pEG包裹厚度為5-10 nm。掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)圖像顯示，溶液中具有45-50 nm尺寸的pEG-Au納米顆粒，參見圖2(a)。圖2(b)和2(c)分別描述了這種顆粒的吸收光譜和該溶液的實(shí)物照片。如吸收光譜所示，該納米顆粒在532 nm附近顯示出強(qiáng)烈的等離子體共振吸收峰。該溶液的濃度是1×1011Nps/mL或1.67×10-15mol/L(摩爾濃度)。圖2(d)表明，光聲信號(hào)幅度與pEG-Au納米顆粒溶液濃度之間存在正相關(guān)關(guān)系。此外，圖2(e)為裝有該溶液的離心管的高光學(xué)對(duì)比度pAT圖像。

1.4 針灸穴位選取

許多研究表明，針灸人或動(dòng)物的特定穴位會(huì)引起功能性腦區(qū)的響應(yīng)[18-25]。 陽陵泉穴(GB34)位于小鼠后肢的外側(cè)，在腓骨頭前下方的的凹陷處，皮下有股二頭肌，膝下外側(cè)動(dòng)、靜脈和腓淺及腓深神經(jīng)分布。GB34是足少陽之脈所入為合的合上穴，為八會(huì)穴之筋會(huì)[26]。大量的研究表明，針刺陽陵泉穴位時(shí)，患有急性腦卒中、帕金森病等神經(jīng)性腦疾病的病人或動(dòng)物會(huì)有不同程度的療效[27-31]。另外，本實(shí)驗(yàn)室以往及近期的研究表明，針刺陽陵泉穴可以產(chǎn)生腦血流動(dòng)力學(xué)改變，有助于緩解血管閉塞，改善體內(nèi)小鼠腦血流灌注不足的血液供應(yīng)[16,17]。本研究選擇位于小鼠右后肢的GB34作為刺激穴位(對(duì)比研究表明，針刺左側(cè)穴位與右側(cè)穴位之間無顯著性差異[16,17])。我們迅速地將無菌不銹鋼針(直徑：0.25 mm；長(zhǎng)度：25 mm)垂直插入陽陵泉穴位處的皮膚中，深度為3-4 mm。然后我們手動(dòng)將針頭以每分鐘60-70下的恒定頻率快速捻轉(zhuǎn)。與之前的研究操作方法一致，在針灸后的兩分半鐘，留針超過30分鐘。

a：pEG-Au納米顆粒的SEM圖； b：吸收光譜圖；c：實(shí)物照片；d：光聲信號(hào)幅度與溶液濃度之間的關(guān)系曲線；e：裝有該溶液的離心管的光聲圖像。a: SEM image of the pEG-Au nanoparticles; b: Optical absorption spectrum; c: photograph of nanoparticle solution; d: Relationship between the solution concentration and relative pA signal amplitude; e: photoacoustic image of the tube containing solution.圖2 金納米顆粒的光學(xué)特性Fig.2 Optical properties of pEG-Au nanoparticles

1.5 實(shí)驗(yàn)操作

為了評(píng)估在金納米粒子以及針灸陽陵泉穴位后小鼠大腦皮層脈管系統(tǒng)的光聲響應(yīng)程度。我們?cè)O(shè)計(jì)了3組pAT實(shí)驗(yàn)。各組小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，先將針灸位置與成像位置脫毛，在GB34穴位處做好標(biāo)記，固定后進(jìn)行光聲層析成像，整個(gè)準(zhǔn)備過程大概需要20分鐘。小鼠每5分鐘進(jìn)行一次pAT腦成像，所有小鼠都處在相同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中。在第一組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)(Group I)中(Group I中使用6只小鼠，寫作n=6)，我們將生理鹽水注射到小鼠尾靜脈中，在注射之前采集一幅圖像，在注射之后采集另外7幅圖像；第二組實(shí)驗(yàn)(Group II，n=8)中，針刺陽陵泉穴位前后共采集8幅圖像；第三組實(shí)驗(yàn)(Group III，n = 8)中小鼠接受兩輪外源刺激，第一輪中將pEG-Au Nps溶液連續(xù)兩次注射到小鼠尾靜脈中，每次注射劑量約為6.67×108Nps/g(體重)，并且在注射前后共采集8幅圖像，之后同一批小鼠接受第二輪實(shí)驗(yàn)，對(duì)每只小鼠在陽陵泉穴處施加針灸刺激，再采集7幅圖像，即Group III中每只小鼠從頭到尾共采集15幅圖像。在pAT實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過注射過量的水合氯醛讓小鼠安樂死。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示。 統(tǒng)計(jì)分析采用非配對(duì)t檢驗(yàn)的方法，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性定義為p≤ 0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)

在這項(xiàng)研究中，為了評(píng)估在沒有外源刺激的實(shí)驗(yàn)中，大腦皮層脈管系統(tǒng)在正常生理?xiàng)l件下的真實(shí)變化，故而設(shè)計(jì)一個(gè)對(duì)照組(Group I)。本組實(shí)驗(yàn)中，每只小鼠都要接受尾靜脈生理鹽水注射。圖3(a)中顯示了Group I中的小鼠大腦皮層的一組光聲圖像，圖像右側(cè)的色標(biāo)是經(jīng)過歸一化的結(jié)果，圖3(b)表示Group I的時(shí)間軸。從圖中可以看出，相比于尾靜脈注射生理鹽水前，注射后的圖像中腦血管變得越來越不清晰，腦血管的光吸收以及成像對(duì)比度很明顯隨著整個(gè)時(shí)間軸呈下降趨勢(shì)，這個(gè)結(jié)果也許是由于小鼠在pAT實(shí)驗(yàn)中，處于負(fù)壓狀態(tài)，負(fù)壓對(duì)血流有一定抑制作用影響。當(dāng)動(dòng)物的身體被綁在支架上，頭部被壓迫在聚乙烯薄膜下面時(shí)，可能會(huì)造成腦部暫時(shí)性的供血不足[32]。

a：第一組實(shí)驗(yàn)中的活體小鼠光聲腦圖像；b：第一組實(shí)驗(yàn)時(shí)間軸a: In vivo photoacoustic images of a mouse brain from Group I; b: Experimental timeline for Group I圖3 對(duì)照組(第一組)實(shí)驗(yàn)的光聲圖像Fig.3 photoacoustic images for the control group (Group I)

2.2 針灸組實(shí)驗(yàn)

圖4(a)為針灸組(Groop II)中小鼠大腦皮層的八幅pAT圖像，圖4(b)表示Group II的時(shí)間軸。本組圖像中，利用了圖像相減的圖像處理方法，將針灸后的每一個(gè)時(shí)刻相對(duì)于針灸前增加的相對(duì)像素值部分用紫色色標(biāo)來表示，即圖像中紫色代表腦血管光吸收或者光對(duì)比度增強(qiáng)的部分。與針刺前的圖像相比，針刺小鼠陽陵泉穴后，皮層靜脈血管能夠更清晰地顯像，皮層血管光學(xué)對(duì)比度得到增強(qiáng)。另外，在注射后15分鐘時(shí)，光吸收增長(zhǎng)量到達(dá)峰值水平，之后光吸收增長(zhǎng)量有所減少，但并未低于初始狀態(tài)，這可能是由于針刺效應(yīng)在減弱。以上結(jié)果表明，針刺陽陵泉穴能促進(jìn)CBF增強(qiáng)以及HbT濃度增加，這可能是由于血液供應(yīng)增加和腦血管阻力降低所致血供改善，與之前本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)論一致[16,17]，即針刺陽陵泉穴可激活一些大腦區(qū)域。然而，并不是所有的大腦區(qū)域在小鼠被針刺之后都具有增加的光學(xué)對(duì)比度。這表明針刺陽陵泉穴不會(huì)將小鼠皮層每一個(gè)腦區(qū)都激活。

2.3 造影劑組實(shí)驗(yàn)以及復(fù)合組實(shí)驗(yàn)

Groop III中小鼠接受兩輪外源刺激，第一輪(造影劑組，Groop III-1st)中將金納米顆粒溶液連續(xù)兩次注射到小鼠尾靜脈中，每次注射劑量約為6.67×108Nps/g(體重)，并且在注射前后共采集8幅圖像如圖5(a)。在注射納米顆粒溶液后，大腦皮層血管與周圍背景組織間的成像對(duì)比度明顯大幅提高，與對(duì)照組的圖像相比，這個(gè)組的皮層脈管系統(tǒng)顯示的非常清晰。此外，注射納米顆粒之后造影劑點(diǎn)亮了一些“隱藏的”靜脈血管(由于其注射造影劑前對(duì)比度低而不可見)，圖像中紅色部分代表第一輪腦血管光吸收或者光對(duì)比度增強(qiáng)的部分?？梢钥闯?，注射后15分鐘，光吸收增長(zhǎng)量到達(dá)峰值水平。結(jié)果表明，造影劑可以有效地提高大腦皮層的對(duì)比度。在達(dá)到峰值后，由于腦血流很快會(huì)對(duì)納米顆粒有一定地清除，光吸收增長(zhǎng)量緩慢下降，直到35 min后圖像采集結(jié)束時(shí)仍保持大于初始狀態(tài)的光吸收水平。此外，并非所有的大腦皮層區(qū)域光學(xué)對(duì)比度都體現(xiàn)出增強(qiáng)，這表明造影劑不能滲透到大腦皮層的每一個(gè)區(qū)域。

之后同一批小鼠接受第二輪實(shí)驗(yàn)(復(fù)合組，Groop III-2nd)，對(duì)每只小鼠在陽陵泉穴處施加針灸刺激，這時(shí)納米粒以及針刺陽陵泉穴同時(shí)作為外源刺激，再采集7幅圖像(見圖5(b))，即Group III中每只小鼠從頭到尾共采集15幅圖像。圖5(c)表示Groop III兩輪實(shí)驗(yàn)的時(shí)間軸。在右腿外側(cè)針刺陽陵泉穴后，腦血管的對(duì)比度又出現(xiàn)第二輪的大幅提高，與第一輪的圖像相比，這個(gè)輪的皮層脈管系統(tǒng)顯示的更為清晰，圖像中藍(lán)色部分代表第二輪腦血管光吸收或者光對(duì)比度增強(qiáng)的部分。可以看出，在45 min處光吸收增長(zhǎng)量到達(dá)第二個(gè)峰值，這是注射金納米顆粒溶液結(jié)合針刺小鼠陽陵泉穴位共同作用引起的小鼠大腦皮層脈管系統(tǒng)的光聲響應(yīng)增強(qiáng)，Groop III驗(yàn)證了針灸輔助金納米粒子的方法可以大大提高大腦皮層血管與周圍背景組織間的成像對(duì)比度與成像分辨率。

a：第二組實(shí)驗(yàn)中活體小鼠光聲腦圖像；b：第二組實(shí)驗(yàn)時(shí)間軸a: In vivo photoacoustic images of a mouse brain from Group II; b: Experimental timeline for Group II圖4 第二組實(shí)驗(yàn)的光聲圖像Fig.4 photoacoustic images for the acupuncture group (Group II)

a，b：Group III-1st組和Group III-2nd組實(shí)驗(yàn)中活體小鼠光聲腦圖像；c：第三組實(shí)驗(yàn)時(shí)間軸a, b: In vivo photoacoustic images of a mouse brain from Group III-1st and Group III-2nd, respectively; c: Experimental timeline for Group III圖5 第三組實(shí)驗(yàn)的光聲圖像Fig.5 photoacoustic images for the acupuncture group (Group III)

2.4 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

我們根據(jù)上述三組實(shí)驗(yàn)計(jì)算了的光聲腦圖像的相對(duì)光吸收變化率，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(具體參見圖6(a))，計(jì)算結(jié)果反映皮層脈管系統(tǒng)對(duì)單一或者復(fù)合外源刺激的響應(yīng)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Group I的最大光吸收下降百分比為8.27%±6.05%(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差SEM)。另外，試驗(yàn)組(Group II，III)與對(duì)照組(Group I)之間有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。Group II中針灸GB34引起的最大光吸收增長(zhǎng)百分比為23.87%±15.95%，Group III-1st中造影劑引起的最大光吸收增長(zhǎng)百分比為38.56%±50.82%。然后Group III-2nd中在兩者共同作用情況下，總的最大光吸收增長(zhǎng)百分比為66.75%+70.87%，其最大增長(zhǎng)率遠(yuǎn)高于Group II和Group III-1st，并且大于兩者之和，由此可以推斷針刺陽陵泉穴位可能在一定程度上增加小鼠腦內(nèi)金納米顆粒的傳遞。圖6(b)列出了Group I，II，III-1st以及III-2nd中腦血管光學(xué)對(duì)比度每隔5 min隨時(shí)間的變化情況。對(duì)于Group I，對(duì)比度先明顯下降，后保持在穩(wěn)定水平。對(duì)于Group II和Group III-1st，對(duì)小鼠施加單一外源刺激后，腦血管對(duì)比度均在第15 min處出現(xiàn)峰值，之后呈現(xiàn)出緩慢的下降震蕩趨勢(shì)。對(duì)于Group III-2nd，對(duì)小鼠施加兩種外源刺激后，腦血管對(duì)比度在第10 min處出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)最大值，之后其變化呈現(xiàn)出緩慢的周期性震蕩趨勢(shì)。我們發(fā)現(xiàn)Group III-2nd組針刺引起的吸收統(tǒng)計(jì)峰值比Group II和Group III-1st早5 min。

a：三組實(shí)驗(yàn)中最大光吸收變化率的統(tǒng)計(jì)直方圖；b：三組實(shí)驗(yàn)中隨時(shí)間軸改變的歸一化相對(duì)光吸收變化率的統(tǒng)計(jì)直方圖a: Histograms of maximum optical contrast variation for three groups of mouse experiments; b: Histograms of optical contrast variation over time for three groups of mouse experiments圖6 三組實(shí)驗(yàn)的相對(duì)光吸收變化率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.6 Histograms of normalized relative optical contrast variation in the mouse brain for three groups of experiments

3 總結(jié)

本文開發(fā)了一種有效的提高對(duì)比度和成像分辨率的方法，該方法集合了兩個(gè)關(guān)鍵外源輔助方法，包括靜脈注射金納米顆粒溶液，以及針刺小鼠陽陵泉穴位(GB34)。利用自主搭建的pAT系統(tǒng)，我們成功地捕獲了由針灸輔助造影劑在活體小鼠大腦皮層中誘導(dǎo)的光學(xué)對(duì)比度隨時(shí)間的變化，證明了兩者共同作用產(chǎn)生的皮層光吸收增強(qiáng)的復(fù)合效應(yīng)遠(yuǎn)大于任何一種單獨(dú)作用產(chǎn)生的效應(yīng)。結(jié)論揭示了該復(fù)合方法有助于更好提高小鼠大腦皮層脈管系統(tǒng)的光聲響應(yīng)，提高大腦皮層血管與周圍背景組織間的成像對(duì)比度，并且能夠讓皮層血管更清晰的顯像。接下來，我們將利用靶向載藥金納米粒子應(yīng)用于活體小鼠腦成像，這可能會(huì)進(jìn)一步揭示針灸特定穴位與造影劑之間的相互作用機(jī)理，這將有助于研究促進(jìn)造影劑以及藥物傳遞和分布的新方法。

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