楊薈楠，趙 暢，李 蓉，沈成興，蔡小舒*，駱城芳

(1.上海理工大學(xué)能源與動力工程學(xué)院， 上海200093； 2.上海市動力工程多相流動與傳熱重點實驗室， 上海 200093；3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院， 上海 200093)

0 引言

近些年來，隨著人民飲食習(xí)慣與生活方式的改變、人口老齡化等原因，冠心病的發(fā)病率逐漸上升，死亡率居高不下。2014年，中國農(nóng)村冠心病的死亡率為143.72/10萬，城市冠心病的死亡率為136.21/10萬[1]。目前臨床上用于診斷冠心病的常見方法為冠狀動脈造影技術(shù)，冠狀動脈造影技術(shù)雖然被稱為診斷冠心病的 “金標(biāo)準(zhǔn)”，但是價格昂貴而且是有創(chuàng)的檢測方法，所以利用心電圖對冠心病進(jìn)行診斷的方法也逐漸發(fā)展起來。心電圖診斷雖然操作簡單方便、價格低廉，但誤診與漏診的情況卻時有發(fā)生，因此無法作為一種可靠的冠心病臨床診斷方法。因此，發(fā)展一種無創(chuàng)的、靈敏度高、可靠性強的冠心病早期快速檢測方法具有非常重要的意義。

表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，對極低濃度的生物分子進(jìn)行檢測[2-4]。例如，Alula等基于SERS光譜技術(shù)，通過光催化作用后的磁性物質(zhì)修飾銀納米顆粒，檢測到尿液中濃度極低的肌酸酐[5]。Ma等基于SERS光譜技術(shù)，利用磁性物質(zhì)誘導(dǎo)納米顆粒聚沉，檢測到細(xì)菌中濃度極低的脫氧核糖核酸[6]。

血小板衍生生長因子-BB(platelet-derived growth factor-BB，pDGF-BB)通過多種機制參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程，與冠心病的關(guān)系較為密切[7]。目前針對pDGF-BB的研究，較多的是基于酶聯(lián)免疫吸附法對血液中的pDGF-BB進(jìn)行檢測。例如，曾宇然等通過酶聯(lián)免疫吸附法對血漿中pDGF-BB濃度進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)pDGF-BB對頸動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程具有重要的作用[8]。本課題組在前期研究中，首先通過自行搭建的785 nm拉曼光譜測試平臺對不同的極低濃度的pDGF-BB水溶液SERS光譜進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)拉曼頻移為1 509 cm-1的拉曼特征峰歸屬于pDGF-BB水溶液[9]。

本文基于SERS光譜技術(shù)60例冠心病患者，其中包括20例行皮冠狀動脈介入治療術(shù)(percutaneous coronary intervention，pCI)病人與40例未行pCI病人以及18例健康人的尿液樣本進(jìn)行檢測， 結(jié)合pDGF-BB拉曼頻移為1 509 cm-1的特征峰進(jìn)行分析，并與醫(yī)院提供的冠狀動脈造影技術(shù)臨床資料對比，發(fā)現(xiàn)兩種方法在判斷心血管堵塞程度是否達(dá)到70%以上吻合度較高，表明該方法有望對冠心病疑似病例進(jìn)行早期診斷，為患者是否需要進(jìn)行pCI提供重要依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗儀器與光譜預(yù)處理

實驗中使用自行搭建的785 nm拉曼光譜測試平臺，如圖1所示，中心波長為785 nm的激光穿過帶通濾波片(OD6，Edmund)聚焦在比色皿上，透鏡組90°接收的拉曼散射光通過光譜儀(iHR320)，由CCD探測器(Horiba-Syncerity)將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，傳輸?shù)接嬎銠C中[10]。光譜采集選擇1 200 grooves/mm的光柵，積分時間10 s，積分次數(shù)4次，采集后首先選擇1 200-1 600 cm-1范圍內(nèi)的光譜[11]，采用4個相鄰像素點的2次savitzky-golay平滑[12]濾除噪聲干擾，同時采用4階多項式擬合進(jìn)行基線校正，從而有效的克服了人工干預(yù)和單次擬合造成的光譜畸變[13]。每個樣本采集5次，取其平均譜線作為后續(xù)分析使用。

1.2 實驗樣本的準(zhǔn)備

實驗中所用的尿液樣本分別采集于60例冠心病患者，其中包括20例行pCI病人，平均年齡為64±15歲；40例未行pCI的病人，平均年齡為61±16歲；18例健康人，平均年齡為52±12歲。所有的健康人與冠心病患者的尿液樣本均由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院提供，為行pCI術(shù)前尿液樣本，采集后保存在4 ℃的恒溫箱中保存一到兩個小時。此外，所有的受試者均簽署知情同意書，對本課題組的實驗研究表示理解與支持。實驗中，大多數(shù)的尿液樣本均無沉淀產(chǎn)生，然而對于某些已產(chǎn)生沉淀的尿液樣本，常常對其進(jìn)行離心處理，取其上清液用于實驗研究。

圖1 785納米拉曼光譜測試平臺Fig.1 The schematic diagram of 785 nm Raman spectrometer

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 冠心病患者與健康人的尿液樣本SERS光譜圖

0.5 mL的冠心病患者以及健康人的尿液樣本上清液分別與1 mL的銀納米膠體溶液(粒徑分布為40-60 nm)均勻混合，置于比色皿中，檢測SERS光譜，實驗結(jié)果如圖2所示。其中譜線(A)為冠心病患者中一例代表性的行pCI病人的尿液樣本SERS光譜，譜線(B)為健康人尿液樣本SERS光譜。通過對比兩條譜線，可以發(fā)現(xiàn)冠心病患者(行pCI病人)尿液樣本SERS光譜中可以檢測到1 509 cm-1的拉曼特征峰，而在健康人尿液樣本中則檢測不到。在前期研究中通過檢測不同極低濃度pDGF-BB水溶液的SERS光譜，可以在濃度低至0.01 ppmol/L的pDGF-BB水溶液中檢測到1 509 cm-1的拉曼特征峰[9]。這就說明了冠心病行pCI患者尿液樣本中pDGF-BB的濃度相對較高；而健康人尿液樣本中的pDGF-BB的濃度低于0.01 ppmol/L或幾乎為零。

2.2 60例冠心病患者尿液樣本與18例健康人尿液樣本SERS平均光譜圖

在實驗中通過785 nm拉曼光譜測試平臺對20例行pCI病人的尿液樣本、40例未行pCI病人的尿液樣本與18例健康人尿液樣本進(jìn)行檢測，取尿液樣本0.5 mL，加入銀納米膠體溶液1 mL，采集SERS光譜。

圖2 冠心病(行pCI)患者(譜線A)與健康人(譜線B)尿液樣本SERS光譜圖Fig.2 The SERS spectra of urine samples from the patient with CHD (with pCI) (Spectrum A) and the healthy human (Spectrum B)

圖3 行pCI病人尿液平均SERS光譜圖(A)、未行pCI病人尿液平均SERS光譜圖(B)與健康人尿液平均SERS光譜圖(C)Fig.3 The average SERS spectra of the urine samples from the patients with pCI (Spectrum A); the patients without pCI (Spectrum B) and the healthy human (Spectrum C)

得到20例行pCI病人尿液樣本、40例未行pCI病人尿液樣本與18例健康人尿液平均SERS光譜如圖3所示：三條尿液平均SERS光譜在結(jié)構(gòu)上很相似，1 245 cm-1、1 268 cm-1、1 281 cm-1、1 320 cm-1、1 390 cm-1、1 464 cm-1、1 568 cm-1的拉曼特征峰在三條平均SERS光譜中均可檢測。這些特征峰對應(yīng)于尿液中有機物的不同共價鍵或者官能團(tuán)的振動模式，例如1 245 cm-1歸屬于酰胺Ⅲ帶無規(guī)則卷曲；1 320 cm-1歸屬于C-H鍵扭轉(zhuǎn)振動[14]；1 460 cm-1歸屬于類脂特征峰，為膜蛋白與膜脂?；鵆H2，CH3的彎曲振動[15]。在三類尿液平均SERS光譜中，可以發(fā)現(xiàn)20例行pCI病人的尿液樣本平均SERS光譜中可以檢測到拉曼頻移約為1 509 cm-1(1 510 cm-1)的特征峰而在40例未行pCI病人尿液樣本平均SERS光譜與18例健康人尿液樣本平均SERS光譜中檢測不到，拉曼峰的略微偏移可能是由于激光器波長的略微偏移所致。這也進(jìn)一步揭示了pDGF-BB在三類尿液樣本中的濃度不同，在行pCI病人尿液中，pDGF-BB的濃度相對較高，在未行pCI病人尿液與健康人尿液中則濃度極低。

2.3 SERS光譜與冠狀動脈造影技術(shù)對比

結(jié)合1 509 cm-1歸屬于pDGF-BB的特征峰，將60例冠心病患者的尿液樣本SERS光譜與冠狀動脈造影技術(shù)臨床資料進(jìn)行對比，結(jié)果如表1所示。其中冠狀動脈造影技術(shù)檢測的心血管包括左主干(left main coronary artery，LM)，左前降支(left anterior descending branch，LAD)，左回旋支(left circumflex artery，LCX)和右冠狀動脈(right coronary artery，RCA)，其中(+)表示行pCI，(-)表示未行pCI。

表1 20例行pCI病人尿液樣本SERS光譜中1 509 cm-1特征峰的檢測結(jié)果與臨床資料對比

Tab.1 The appearance of 1 509 cm-1measured by SERS and clinical data of 20 patients with pCI

編號1509cm?1+/?LAD%LCX%LM%RCA%總和%1√+9585?602402√+4060?901903√+50100?502005×+4095?902257√+509050902808√+4090405022011√+???959512√+6090?5020014√+100??9519519√+?90?8017020√+???999930√+?90??9031√+?90?6015032×+3070??10034√+70???7040√+909030?21042√+?80?5013043×+90??6015046√+?85?8016547√+50??90140

通過分析20例行pCI病人的尿液SERS光譜發(fā)現(xiàn)，85%的行pCI病人的尿液樣本中均可檢測到1 509 cm-1的特征峰；而且行pCI病人的心血管堵塞程度非常嚴(yán)重，均存在有一單支心血管堵塞程度不小于70%。例如，20號、30號、31號病人的冠狀動脈造影圖如圖3所示，20號病人RCA堵塞程度為99%，如圖3(a)所示；30號病人LCX堵塞程度為90%，如圖3(b)所示；31號病人LCX堵塞程度為90%，如圖3(c)所示。這也就進(jìn)一步表明了，當(dāng)病人的單支心血管堵塞程度不小于70%，其尿液SERS光譜中可以檢測到1 509 cm-1的拉曼特征峰，5號、32號以及43號病人除外，這可能是因為在檢測過程中這些病人尿液樣本中的pDGF-BB已完全變性。通過分析40例未行pCI病人的尿液SERS光譜發(fā)現(xiàn)，87.5%的尿液樣本中均檢測不到1 509 cm-1的特征峰；而且未行pCI病人的心血管堵塞程度輕，單支心血管的堵塞程度均小于70%，6號病人RCA未見明顯堵塞，如圖3(d)所示。綜上所述，以上兩類病人所占總病人的比例為86.7%。

圖4 (a)20號病人RCA動脈造影圖像；(b)30號病人LCX動脈造影圖像；(c)31號病人LCX動脈造影圖像；(d)6號病人RCA動脈造影圖像Fig.4 (a) The image of coronary angiography of RCA from patient No.20; (b) The image of coronary angiography of LCX from patient No.30; (c) The image of coronary angiography of LCX from patient No.31; (d) The image of coronary angiography of RCA from patient No.6

值得注意的是，在40例未行pCI病人尿液的SERS光譜中，有幾例樣本可以檢測到1 509 cm-1的特征峰，如表2與表3所示。

表2 未行pCI病人尿液SERS光譜中1 509 cm-1特征峰檢測結(jié)果與臨床資料對比(1)

Tab.2 The appearance of 1 509 cm-1measured by SERS and clinical data of patients without pCI (part I)

編號27361509cm?1√√(+)/(-)??LAD%?30LCX%3040LM%??RCA%50?總和%8070

從表2中可以看出，27號病人與36號病人的單支心血管的堵塞程度均小于70%，但LAD/LCA/LM/RAC的堵塞程度總和卻不小于70%。這也就說明了，當(dāng)病人各支心血管堵塞程度總和不小于70%時，同樣可以在其尿液樣本SERS光譜中檢測到1 509 cm-1特征峰，這部分病人所占所有未行pCI病人的比例為5%。

表3 未行pCI病人尿液SERS光譜中1 509 cm-1特征峰檢測結(jié)果與臨床資料對比(2)

Tab.3 The appearance of 1 509 cm-1measured by SERS and clinical data of patients without pCI (part II)

編號4150511509cm?1√√√(+)/(-)???LAD%603030LCX%???LM%???RCA%???總和%603030

從表3中可以看出，41號、50號、51號病人的單支心血管堵塞程度小于70%，而各支心血管的堵塞程度總和也小于70%，而在這些病人的尿液樣本SERS光譜中卻可以檢測的1 509 cm-1的特征峰。結(jié)合醫(yī)院提供的病人腦部CT與頸動脈彩超等臨床資料，發(fā)現(xiàn)這類病人存在著不同程度的腦梗塞與頸動脈血管的堵塞情況，從而造成體內(nèi)pDGF-BB濃度的上升，這類病人占所有未行pCI病人的比例為7.5%。

3 結(jié)論

基于SERS光譜對20例行pCI病人尿液樣本、40例未行pCI病人尿液樣本以及18例健康人尿液樣本進(jìn)行檢測，并結(jié)合拉曼頻移為1 509 cm-1歸屬于pDGF-BB的拉曼特征峰對尿液SERS光譜進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)行pCI病人的尿液樣本中可檢測到1 509 cm-1的特征峰；健康人與大多數(shù)未行pCI病人的尿液樣本中則檢測不到1 509 cm-1的特征峰。同時結(jié)合醫(yī)院提供的冠狀動脈造影技術(shù)臨床資料，發(fā)現(xiàn)這種檢測方法與判斷心血管堵塞程度是否大于70%的吻合度較好，通過判別1 509 cm-1的拉曼特征峰對冠心病疑似病例單支血管堵塞程度是否大于70%的診斷靈敏度與特異性分別為85%；87.5%，所以該方法有望發(fā)展成為判斷冠心病患者是否需要行pCI的重要依據(jù)，為冠心病疑似病例的早期診斷提供非常有價值的信息。

[1] 隋輝, 陳偉偉, 王文. 《中國心血管報告2015》要點解讀[J]. 中國心血管雜志, 2016, 21(4):259-261.

SUI Hui, CHEN Weiwei, WANG Wen. Interpretation of reporter on cardiovascular disease in China (2015)[J]. Chin J Cardiovasc Med, 2016, 21(4):259-261.

[2] LIN J Q, CHEN R, FENG S Y,etal. A novel blood plasma analysis technique combining membrane electrophoresis with silver nanoparticle-based SERS spectroscopy for potential application in noninvasive cancer detection[J]. Nanomedicine:Nanotechnology, Biology, and Medicine, 2011, 7(5):655-663.

[3] 周明輝, 廖春艷, 任兆玉, 等. 表面增強拉曼光譜生物成像技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 中國光學(xué), 2013, 6(5):633-642.

ZHOU Minghui, LIAO Chunyan, REN Zhaoyu,etal. Bioimaging technologies based on surface-enhanced Raman spectroscopy and their applications[J]. Chinese Optics, 2013, 6(5):633-642.

[4] GRETA D M, SILVIA C, ELENA M,etal. Surface-enhanced Raman spectroscopy of urine for prostate cancer detection:a preliminary study[J]. Anal Bioanal Chem, 2015, 407(12):3271-3275.

[5] MELISEW T A, JYISY Y. photochemical decoration of magnetic composites with silver nanostructures for determination of creatinine in urine by surface-enhanced Raman spectroscopy[J]. Talanta, 2014, 130(5):55-62.

[6] MA Q, LI Y L, GONG N C,etal. Surface enhanced Raman spectroscopy sensor based on magnetic beads-induced nanoparticles aggregation for detection of bacterial deoxyribonucleic acid[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2015, 43(11):1676-1681.

[7] 路雅茹, 秦勤. 血小板衍生生長因子—B與冠心病研究進(jìn)展[J]. 天津醫(yī)藥, 2012, 40(5):525-527.

LU Yaru, QIN Qin. The research about the relationship between pDGF-B and coronary heart disease[J]. Tianjin Medical Journal, 2012, 40(5):525-527.

[8] 曾宇然, 王偉鴻, 盧敏, 等. 血漿透析患者血漿中血小板源性生長因子BB的表達(dá)及意義[J]. 中國實用醫(yī)刊, 2014, 41(3):4-6.

ZENG Yuran, WANG Weihong, LU Min,etal. Expression of platelet derived growth factor-BB in maintenance hemodialysis patients[J]. Chinese Journal of practical Medicine, 2014, 41(3):4-6.

[9] 趙暢, 李蓉, 楊薈楠, 等. 基于表面增強拉曼光譜檢測尿液樣本中血小板衍生生長因子—BB方法研究[J]. 中國激光, 2017, 44(08):0811002.

ZHAO Chang, LI Rong, YANG Huinan,etal. Measurement of platelet derived factor-BB in urine samples based on surface-enhanced Raman spectroscopy[J]. Chinese Journal of Lasers, 2017, 44(08):0811002.

[10] 王琴, 趙暢, 楊薈楠, 等. 激光拉曼光譜法同步測量液膜厚度與濃度[J]. 激光與光電子進(jìn)展, 2016, 53(9):093001.

WANG Qin, ZHAO Chang, YANG Huinan,etal. Simultaneous measurement of film thickness and mass fraction by Raman spectroscopy[J]. Laser & Optoelectronics progress, 2016, 53(9):093001.

[11] CRAIG S, CLEMENTS J M, COOK A L,etal. Characterization of the structure and conformation of platelet-derived growth factor-BB and proteinase-resistant mutants of pDGF-BB expressed in Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochemical Journal, 1992， 281(1):67-72.

[12] 章穎強, 董偉, 張冰, 等. 基于拉曼光譜和最小二乘支持向量機的橄欖油摻偽檢測方法研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2012, 32(6):1554-1558.

ZHANG Yingqiang, DONG Wei, ZHANG Bin,etal. Research on detection method of adulterated olive oil by Raman spectroscopy and least squares support vector machine[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2012, 32(6):1554-1558.

[13] 李雷, 魏連鑫. 自適應(yīng)小波閾值函數(shù)的指紋圖像去噪[J]. 上海理工大學(xué)學(xué)報, 2014, 36(02):154-157.

LI Lei, WEI Lianxin. Adaptive wavelet threshold function for fingerprint denoising[J]. Journal of University of Shanghai for Science and Technology. 2014, 36(02):154-157.

[14] 馮尚源, 潘建基, 伍嚴(yán)安, 等. 基于SERS技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計分析胃癌患者血漿拉曼光譜[J]. 中國科學(xué)：生命科學(xué), 2011, 41(7):550-557.

FENG Shangyuan, pAN Jianji, WU Yanan,etal. Study on gastric cancer blood plasma based on surface-enhanced Raman spectroscopy combined with multivariate analysis[J]. Sci China Life Sci, 2011, 41(7):550-557.

[15] 郭麗. 用多元分析方法研究乳腺癌血清的SERS光譜[D]. 遼寧：大連理工大學(xué), 2011:51-53.

GUO Li. Multivariate statistical analysis of serum from breast cancer patients using surface-enhanced Raman spectrum[D]. Liao Ning:Dalian University of Technology, 2011： 51-53.