嚴(yán)忠雍，張小軍，陳雪昌，方 益，張 帥，孫秀梅*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江 舟山 316021;2.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021)

圖1 3種六溴環(huán)十二烷的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Chemical structures of HBCDs

六溴環(huán)十二烷( Hexabromocyclododecanes，HBCDs)屬脂環(huán)族溴系添加型阻燃劑，主要用于阻燃聚苯乙烯泡沫材料、紡織品、環(huán)氧樹脂、硅樹脂等。HBCDs由于缺乏化學(xué)鍵作用，易在產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用、回收和最終處理過程中釋放出來，造成環(huán)境污染[1]。HBCDs作為高持久性、高生物蓄積性和毒性物質(zhì)，主要有3對對映結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體，分別為(±)α-HBCD(10%～13%)、(±)β-HBCD(1%～12%)、(±)γ-HBCD(75%～89%)[2]，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。HBCDs在環(huán)境中難降解，可以長期存在，并可通過水體、沉積物進(jìn)入水生生物鏈中對生態(tài)環(huán)境及動(dòng)物造成傷害，其對動(dòng)物的大腦、肝臟、腎臟等器官以及內(nèi)分泌、生殖發(fā)育系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)有毒性，因而受到各研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[3-6]。2013年5月HBCDs被列入《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》禁用化學(xué)制品黑名單。2017年起中國將HBCDs增列至《中國嚴(yán)格限制進(jìn)出口的有毒化學(xué)品目錄》，禁止HBCDs的生產(chǎn)、使用和進(jìn)出口[7]。為科學(xué)評估HBCDs的危害，非常有必要建立海洋生物體中六溴環(huán)十二烷的檢測方法。

HBCD在環(huán)境樣品中的分析檢測屬于復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分析檢測，可采用氣相色譜(GC)或氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)進(jìn)行測定，但HBCD在160 ℃會(huì)發(fā)生3種異構(gòu)體間的互相轉(zhuǎn)化，在240 ℃以上產(chǎn)生脫溴降解現(xiàn)象，進(jìn)一步限制了GC法對HBCD 的測定。當(dāng)前對HBCD 異構(gòu)體的測定普遍采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)[8-14]，該方法的靈敏度高、選擇性和特異性好。出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3543-2013《出口食品中三種六溴環(huán)十二烷的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[15]規(guī)定試樣中的六溴環(huán)十二烷經(jīng)二氯甲烷索氏提取，提取液經(jīng)凝膠色譜柱凈化，正己烷二氯甲烷洗脫，然后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。該標(biāo)準(zhǔn)雖達(dá)到了HBCD的分析要求，但前處理步驟繁瑣耗時(shí)，且須配備儀器輔助凈化，不適合規(guī)模樣品檢測和方法技術(shù)推廣。本方法以固相萃取為凈化手段，通過高效液相色譜柱分離，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定海洋生物體中α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD含量，內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜-質(zhì)譜儀Quattro Premier XE(配備電噴霧離子源，美國Waters公司);R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；MS3旋渦混合器(德國IKA公司)；超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation公司)；Centrifuge5810高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；12通道固相萃取裝置(美國Supelco公司)；硅膠固相萃取柱(6 mL/1 000 mg，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

HBCDs標(biāo)準(zhǔn)品及其同位素標(biāo)記物(100 mg/L，美國Accustandard公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；正己烷、二氯甲烷(色譜純，美國J.T.Baker公司)；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Millipore系統(tǒng)處理的超純水。

六溴環(huán)十二烷混合標(biāo)準(zhǔn)使用液(100 μg/L)：移取適量六溴環(huán)十二烷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋配成100 μg/L混合溶液，4 ℃冷藏保存，有效期1個(gè)月。

六溴環(huán)十二烷混合內(nèi)標(biāo)使用液(100 μg/L)：移取適量六溴環(huán)十二烷混合內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇逐級稀釋配成100 μg/L混合溶液，4 ℃冷藏保存，有效期1個(gè)月。

1.2 樣品前處理方法

稱取5.00 g(準(zhǔn)確至0.01 g)均質(zhì)后的待測樣品，置于50 mL離心管中，加入100 μL同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液，再加入15 mL正己烷，渦旋振蕩1 min，超聲振蕩10 min后，6 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶；殘?jiān)?5 mL正己烷按上述方法再提取1次，所得上清液合并至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，在40 ℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，加入5 mL正己烷溶解，超聲振蕩1 min備用。

移取提取液加至已用5 mL正己烷活化的硅膠固相萃取柱上，先用2 mL正己烷淋洗，再用5 mL二氯甲烷洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min，用15 mL離心管收集洗脫液，洗脫液于40 ℃氮?dú)獯蹈?，用甲醇定容?.0 mL，旋渦振蕩1 min，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，待儀器分析。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：ACQUITYTMUPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；進(jìn)樣體積10 μL；樣品室溫度6 ℃；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相：A為純水，B為甲醇乙腈溶液(4∶6，體積比);梯度洗脫：0～1.0 min，80%～25% A；1.0～8.0 min，25%～15%A;8.0～8.1 min，15%～80% A；8.1～10.0 min，80% A。

表1 六溴環(huán)十二烷的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of HBCDs

*quantitative ion

電噴霧離子源，負(fù)離子掃描(Electrospray ionization，ESI-)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；錐孔電壓：18 V；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：360 ℃；錐孔氣流量：100 L/h；脫溶劑氣流量：800 L/h；六溴環(huán)十二烷的母離子及子離子等質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測條件如表1所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD 3種化合物屬于同分異構(gòu)體，且監(jiān)測的特征離子信息相同，無法實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜上的分離，所以在液相色譜上必須實(shí)現(xiàn)3種化合物的有效分離。選用ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)作為六溴環(huán)十二烷的色譜分離柱，選擇純水為水相，分別考察了甲醇、乙腈作為流動(dòng)相的有機(jī)相時(shí)的分離效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)使用甲醇作為有機(jī)相時(shí)，α-HBCD與β-HBCD、γ-HBCD能有效分離，但β-HBCD與γ-HBCD不能分離；當(dāng)使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，γ-HBCD與α-HBCD、β-HBCD能有效分離，但α-HBCD與β-HBCD不能分離。即使調(diào)整甲醇、乙腈的梯度，也無法保證α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD的有效分離。而選擇甲醇-乙腈混合溶液(4∶6)為有機(jī)相，可使α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD在10 min內(nèi)于液相色譜上得到有效分離，且分離度好，峰形尖銳。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

采用蠕動(dòng)泵注射直接進(jìn)樣方式對1 mg/L 的HBCD和13C-HBCD標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，使用ESI源在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)亩ㄐ?、定量離子和電離方式。結(jié)果表明：在ESI-模式下，HBCD呈現(xiàn)出最佳響應(yīng)，特征離子[M-H]-是響應(yīng)強(qiáng)度最高的離子，選作母離子。然后進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，找出二級質(zhì)譜中兩個(gè)信號較強(qiáng)的碎片離子，以信號最強(qiáng)的作定量離子，另一個(gè)作輔助定性離子，并對碰撞能量、錐孔電壓、毛細(xì)管電壓、離子源溫度、錐孔氣流量、脫溶劑氣流量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的質(zhì)譜條件見表1。

2.3 提取條件的優(yōu)化

分別采用丙酮、正己烷、甲醇、乙腈作為萃取劑提取樣品中六溴環(huán)十二烷，用加標(biāo)回收率間接判斷試劑的提取效率。結(jié)果表明，丙酮的回收率為62%～73%，正己烷的回收率為89%～98%，甲醇的回收率為71%～78%，乙腈的回收率為86%～93%。數(shù)據(jù)表明正己烷提取六溴環(huán)十二烷時(shí)的回收率最高，提取效果最好，而乙腈雖有較高的回收率，但提取后易與水互溶，導(dǎo)致旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過慢，降低了實(shí)驗(yàn)效率，最終選擇正己烷作為提取劑。

為進(jìn)一步提高正己烷的提取效率，分別考察了正己烷提取1次、2次、3次、4次時(shí)對六溴環(huán)十二烷回收率的影響，結(jié)果顯示，3種六溴環(huán)十二烷的提取率相近，而且當(dāng)提取次數(shù)超過2次后，六溴環(huán)十二烷的回收率趨于穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)選用正己烷提取2次。

2.4 洗脫條件的選擇

硅膠固相萃取柱具較強(qiáng)的極性作用力，屬于正相萃取柱；通常根據(jù)洗脫溶劑的極性，選擇合適的洗脫強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)分別采用環(huán)己烷、二氯甲烷、乙腈和甲醇(極性由弱到強(qiáng))作為洗脫溶劑，通過比較不同溶劑的回收率、基質(zhì)效應(yīng)和洗脫體積，選擇合適的洗脫溶劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：環(huán)己烷由于洗脫強(qiáng)度較弱，無法有效洗脫六溴環(huán)十二烷；甲醇和乙腈雖能有效洗脫六溴環(huán)十二烷，但甲醇的洗脫雜質(zhì)較多，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重；乙腈不易用氮?dú)獯蹈?，在濃縮階段耗時(shí)長，降低了實(shí)驗(yàn)效率；二氯甲烷不僅能有效洗脫六溴環(huán)十二烷，無明顯基質(zhì)效應(yīng)，且5 mL用量即能獲得完全有效洗脫，易于氮吹濃縮。實(shí)驗(yàn)對比了不同二氯甲烷洗脫體積下六溴環(huán)十二烷的回收率，結(jié)果表明，3種六溴環(huán)十二烷的回收率相近，且回收率隨著洗脫體積的增大而增加，洗脫體積為5 mL時(shí)回收率達(dá)最大且趨于穩(wěn)定。故實(shí)驗(yàn)選擇洗脫溶劑為5 mL二氯甲烷。

2.5 線性范圍與定量下限

準(zhǔn)確移取適量HBCD混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和13C-HBCD內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，用甲醇稀釋成0.50、1.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液中的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度均為10.0 μg/L，除不加樣品外，按照樣品處理方法進(jìn)行操作和測定。在最佳儀器條件下，得到3種六溴環(huán)十二烷的線性范圍均為0.50～100.0 μg/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。分別在實(shí)際海洋生物體樣品中添加六溴環(huán)十二烷，按3倍信噪比確定方法的檢出限為0.06 μg/kg，按10倍信噪比確定方法的定量下限為0.20 μg/kg，不同海洋生物體中HBCD的信噪比無顯著差別，且回收率穩(wěn)定，表明無明顯基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 回收率與精密度

在陰性烏賊、貽貝、日本對蝦和紫菜樣品中添加3個(gè)不同濃度的六溴環(huán)十二烷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，計(jì)算回收率和精密度(見表2)。結(jié)果表明，在0.5、2.5、10.0 μg/kg加標(biāo)水平下，六溴環(huán)十二烷在樣品中的平均回收率為85.6%～97.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.9%～8.8%。2.5 μg/kg加標(biāo)烏賊樣品的譜圖見圖2。

表2 六溴環(huán)十二烷的平均回收率及精密度(n=6)Table 2 Average recoveries and precisions for HBCDs(n=6)

2.7 實(shí)際樣品的測定

采用污染魚飼料投喂的暴露方式，以保證魚體對HBCDs的最大攝入和吸收。分別準(zhǔn)確稱取魚飼料15 g，取1 mg/L的六溴環(huán)十二烷混合標(biāo)準(zhǔn)使用液1.5 mL,與5 mL丙酮混合，噴灑于15 g魚飼料。配制成0.1 μg/g的α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD污染飼料。在毒理培養(yǎng)室活性炭過濾的密閉循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行試驗(yàn)(室溫，白天28 ℃，晚間24 ℃，相對濕度70%)，設(shè)對照組和HBCDs暴露組，將供試青鳉魚馴養(yǎng)數(shù)天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。暴露飼養(yǎng)時(shí)間為30 d，每天根據(jù)魚體數(shù)量投喂一定量的污染餌料和對照餌料，間隔固定時(shí)間取樣分析；取樣后的生物樣品，應(yīng)立即稱重并真空冷凍干燥；采用本方法測定生物樣品中的HBCDs。結(jié)果表明：在加入各異構(gòu)體HBCD喂養(yǎng)30 d 后，α-HBCD喂養(yǎng)組魚體肌肉中α-HBCD的濃度達(dá)到17.35 ng/g濕重；β-HBCD喂養(yǎng)組魚體肌肉中β-HBCD的濃度為3.40 ng/g濕重(見圖3)；γ-HBCD喂養(yǎng)組魚體肌肉中γ-HBCD的濃度為4.09 ng/g濕重。

圖2 2.5 μg/kg加標(biāo)烏賊樣品的MRM圖Fig.2 MRM chromatograms of spiked(2.5 μg/kg) squid sample

圖3 β-HBCD喂養(yǎng)組青鳉樣品的MRM圖Fig.3 MRM chromatograms of feeding experiments with β-HBCD

3 結(jié) 論

海洋生物體中六溴環(huán)十二烷含量一般在μg/kg級，給試樣的分析提出了較高的要求。本方法采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，具有較高的選擇性、靈敏度和準(zhǔn)確性，輔以硅膠固相萃取凈化樣品，使方法定量下限達(dá)到0.20 μg/kg；對頭足類、貝類、甲殼類、藻類等海洋生物體進(jìn)行不同濃度水平(0.5～10.0 μg/kg)的加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率為85.6%～97.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%～8.8%。本方法穩(wěn)定可靠，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可滿足目前各實(shí)驗(yàn)室對海洋生物體中六溴環(huán)十二烷的分析檢測要求及海洋監(jiān)測規(guī)范對該濃度級別檢測方法的要求。

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