滿 嬌，張 武

（大理大學 農(nóng)學與生物科學學院，云南 大理 671003）

青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的一種植物細菌性疾病，可侵染許多重要經(jīng)濟作物（如馬鈴薯、花生、番茄、煙草、甘薯、茄子等）以及一些貴重藥材和花卉，特別是對茄科植物的危害更大[1]。青枯病是世界上危害最大、分布最廣和造成損失最為嚴重的植物病害之一，該病的發(fā)生、傳播和防治一直是國內外研究的重點和熱點。

青枯雷爾氏菌作為革蘭氏陰性菌的一種，可通過分泌效應物[2]（effectors，專指病原菌分泌到宿主植物體內的分泌蛋白）引起致病侵染，研究其分泌機制對于病原菌的致病機理具有重要意義[3]。分泌蛋白是由細胞合成并分泌到質膜外的蛋白質，分為兩大類，一類是經(jīng)典分泌蛋白（classical secreted protein），該類分泌蛋白的N-端含有16～26個疏水性氨基酸殘基組成的信號肽；另一類為非經(jīng)典分泌蛋白，這類分泌蛋白缺少信號肽，III型分泌系統(tǒng)（type III secretion systems，T3SS）產(chǎn)生的分泌蛋白即為信號肽非依賴性。III型分泌蛋白作為重要的效應物蛋白，在許多植物-病原微生物互作過程中發(fā)揮極其關鍵的作用[4]。

分泌蛋白的研究可以用實驗檢測和理論預測兩種方法。常規(guī)的蛋白質實驗檢測可以用western blot和Elisa（酶聯(lián)免疫吸附測定），而Matthew等使用MALDI-TOF質譜儀，通過對細菌蛋白質組特異性修飾，可以直接從菌落中檢測細菌的分泌蛋白，甚至識別病原菌的毒力和侵染蛋白質[5]。近年來，隨著生物信息學和第三代單分子測序的迅猛發(fā)展，利用已有的蛋白質數(shù)據(jù)庫去預測和分析分泌蛋白，進而通過實驗驗證已成為蛋白質組研究的常用手段，可以大大減輕繁瑣的實驗工作量。本文對青枯雷爾氏菌III型分泌蛋白的預測及分析，將有助于深入研究病原菌和宿主植物互作的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗材料是青枯雷爾氏菌全蛋白質組的5 116個蛋白質，氨基酸序列由NCBI數(shù)據(jù)庫獲得。青枯雷爾氏菌基因組大小約5.8 Mb，是由3.7 Mb的環(huán)形染色體和2.1 Mb的大質粒所組成，具有高GC含量。

1.2 方法

EffectiveDB（http://www.effectors.org/）是一個預測III型分泌系統(tǒng)的工具，主要功能是預測蛋白質是否具有III型分泌特征。EffectiveCCBD預測是否有伴侶蛋白結合在分泌蛋白25～70位氨基酸結合位點上，伴侶蛋白的目的是提高III型分泌蛋白在分泌前及分泌時的穩(wěn)定性，這是III型分泌系統(tǒng)所產(chǎn)生的分泌蛋白的特別屬性。

本文首先用EffectiveDB和EffectiveCCBD篩選出含有III型分泌系統(tǒng)的分泌蛋白，其次分別使用信號肽預測軟件SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和非經(jīng)典分泌蛋白預測軟件SecretomeP2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）剔除掉可能含有信號肽的分泌蛋白，再結合結構域預測軟件SMART、ExPASy在線分析III型分泌蛋白的結構、功能并進行常規(guī)特征描述。

2 結果與分析

2.1 III型分泌蛋白的預測

利用EffictiveDB、EffectiveCCBD、SignalP4.1和SecretomeP2.0對青枯雷爾氏菌的5 116個蛋白質氨基酸序列進行預測和分析，共得到156個III型分泌蛋白，約占蛋白質總數(shù)的3.05%。

2.2 III型分泌蛋白的功能預測及分析

經(jīng)過預測后，對其功能進行初步分析，發(fā)現(xiàn)在156個III型分泌蛋白中，75個為有功能描述的蛋白質，81個為假定蛋白（hypothetical protein）。圖1為156個蛋白質的功能分類。

細菌T3SS分泌的效應蛋白大致可分為4類[4]：第一類為細胞質膜上的分泌系統(tǒng)自身組裝蛋白；第二類為轉位子蛋白，主要能在細胞膜上形成跨膜通道，使效應蛋白通過；第三類為分泌的效應蛋白，這是T3SS產(chǎn)生的關鍵效應物，這類蛋白與病原微生物的致病侵染密切相關，被轉移進入寄主細胞引起相應的病理變化；第四類為T3SS 伴侶蛋白，與特異的效應蛋白結合，保護效應物在未分泌前不被降解，并能有效地分泌、轉移效應蛋白。前兩大類蛋白質，一共有31個（圖1B），約占整個III型分泌蛋白的20%，由此可見，細菌T3SS在組裝自身分泌裝置方面消耗了大量的能量與精力。在有功能描述的分泌蛋白中，編碼III型分泌系統(tǒng)的許多結構基因與編碼細菌的鞭毛裝置基因具有一定的同源性[6]，鞭毛蛋白在細菌表面組裝鞭毛裝置，可能同分泌蛋白運輸?shù)剿拗黧w內有關。絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心而命名的蛋白水解酶，在真菌中絲氨酸蛋白酶與病原菌的侵染密切相關，通常用來降解宿主植物體內的蛋白質[7]，這說明絲氨酸蛋白酶可能與青枯雷爾氏菌的侵染相關。

圖1 青枯雷爾氏菌III型分泌蛋白功能分類

在其它III型分泌蛋白中，還發(fā)現(xiàn)了青霉素結合蛋白和熱休克蛋白，這兩種蛋白質在其它微生物中廣泛存在[8]，是病原微生物在逆境條件下抗脅迫的分子基礎，可以擴大細菌在不良環(huán)境中的耐受性和生存范圍。在本次預測中還發(fā)現(xiàn)了AvrA蛋白，藺志杰[9]發(fā)現(xiàn)在腸炎沙門菌中AvrA效應蛋白為抑制炎癥分子，在腸炎沙門菌感染宿主過程中可抑制宿主細胞的過度炎性反應，推測此種III型分泌蛋白在青枯雷爾氏菌中可能也有抑制宿主植物過敏反應的功能。HrpB和HrcU （hypersensitive response，HR，過敏反應）主要功能是抑制宿主植物的基礎抗性或者防衛(wèi)反應，調控其他T3SS相關基因的表達。另外，通過位置分析，發(fā)現(xiàn)HrcU和HrpB等4個III型分泌蛋白的基因集中位于青枯雷爾氏菌的大質粒上，有可能形成一個“毒力島”，這與很多病原微生物的毒力蛋白基因分布是高度一致的[10-11]。表1是部分青枯雷爾氏菌III型分泌蛋白的常規(guī)特征描述，由 ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）在線分析完成。

表1 部分典型III型分泌蛋白特征描述

為了更好的分析III型分泌假定蛋白在青枯雷爾氏菌中的功能，我們用SMART軟件進行結構域分析。Hemolysin Cabind是在假定蛋白中含量最多的一種結構域，包括HlyD結構域，這兩種結構域功能與表1中鈣結合溶血素蛋白功能類似，是一種鈣結合細菌溶血素蛋白，含有此類結構的分泌蛋白可能在鈣離子的介導下進入到宿主植物體內，與細菌產(chǎn)生毒力和致病性有關（Hemolysin Cabind等結構域功能在歐洲分子生物學實驗室EMBL-EBI網(wǎng)站的PFAM中查詢）；假定蛋白中的Flagellin_N結構域與鞭毛組裝有關，可能參與青枯雷爾氏菌T3SS系統(tǒng)的組裝。

5 結論

本文主要利用生物信息學工具來預測和分析青枯雷爾氏菌的III型分泌蛋白及其功能，結果發(fā)現(xiàn)，III型分泌蛋白作為重要的致病因子，除部分蛋白質功能未知外，還包括有外膜/孔道蛋白、鞭毛蛋白、抗應激蛋白、絲氨酸蛋白酶、鈣結合溶血素蛋白等類型，主要參與了鞭毛合成、毒力侵染等過程。

目前，由青枯雷爾氏菌引起的病害是災難性的，所以，對其基因組和蛋白質組進行生物信息學分析、掌握分泌蛋白的致病侵染的機制非常必要。本文改進的方法是結合實驗檢測方法，可以提取青枯雷爾氏菌的分泌蛋白進行分離純化和分析鑒定，且在代謝組水平上全面分析基因的功能和彼此形成的代謝調控網(wǎng)絡。了解青枯雷爾氏菌在寄主植物體內的致病機理，對于青枯病的控制具有重要的現(xiàn)實意義。

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