王夢姣

(1.陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000； 2.陜西理工大學(xué)陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723000； 3.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000)

植物根際微生物是根際微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，能夠直接影響土壤物理結(jié)構(gòu)，對土壤肥力、植物營養(yǎng)轉(zhuǎn)化起決定性作用,是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)[1-2]。對農(nóng)作物根際微生物結(jié)構(gòu)組成、空間分布、多樣性變化趨勢的分析，有助于從微生物角度改善土壤環(huán)境和土壤結(jié)構(gòu)，對進(jìn)一步研究根際微生物與農(nóng)作物的互作關(guān)系，提高陜南農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的理論和實踐意義。

目前，人們對小麥(TriticumaestivumL.)、玉米(ZeamaysLinn.)等作物的根際微生物多樣性進(jìn)行了許多研究，均發(fā)現(xiàn)根際微生物多樣性與作物的生長發(fā)育密切相關(guān)[3-4]。例如，胡桂萍等[5]針對水稻內(nèi)生菌和根際微生物群落多樣性進(jìn)行共同研究發(fā)現(xiàn)，不同水稻品種其根際微生物群落多樣性具有顯著差異；借助根際微生物群落多樣性的平臺，劉波等[6]進(jìn)行新的微生物分離方法的研究，這為從不同發(fā)育時期分離不同微生物，并對其功能研究提供了新的思路；張仕穎等[7]利用丁草胺污染對水稻及水稻根際微生物區(qū)系作用的試驗闡明了外界影響能夠?qū)λ靖H微生物群落特征有顯著影響，這也反應(yīng)了在“根際微生物-土壤-作物”這個微生態(tài)系統(tǒng)中，根際微生物的變化能夠直接關(guān)聯(lián)作物的生長發(fā)育；化感水稻根際微生物的生物學(xué)特性研究[8]，可以使我們了解特定水稻品種的根際微生物的生態(tài)學(xué)特性。這些研究結(jié)果都證明，水稻根際微生物與水稻生長發(fā)育密切相關(guān)，根際微生物多樣性與作物的生長發(fā)育存在緊密的互作和聯(lián)系[9-10]。

陜西南部地區(qū)是陜西省水稻的主產(chǎn)區(qū)，也是中國重要的水稻主產(chǎn)區(qū)[11]，該地區(qū)的水稻種植方式屬于輪作制[12]。前人研究還未涉及到陜南這一具有油菜-水稻輪作制耕種體系的根際微生物多樣性分析，本研究旨在利用培養(yǎng)法研究陜南水稻-油菜輪作區(qū)的2個水稻品種在其五葉期、分蘗期、孕穗期[13-14]的根際細(xì)菌多樣性組成，擬從土壤細(xì)菌層面探討水稻生長發(fā)育與根際細(xì)菌之間的關(guān)系，為進(jìn)一步指導(dǎo)實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地及水稻概況

本試驗在陜西南部地區(qū)水稻主要種植區(qū)漢濱、城固和寧強[15-16]進(jìn)行，這3個采樣地氣候分別屬于亞熱帶大陸性季風(fēng)氣候、北亞熱帶濕潤季風(fēng)區(qū)和暖溫帶山地濕潤季風(fēng)氣候，降水集中在9月，經(jīng)度分別為109°01′ E、107°13′ E、105°60′ E，緯度分別為32°42′N、32°75′N、32°55′N，海拔高度分別為260 m、480 m、820 m，供試土壤均為潴育性水稻土，灌溉水源均為河水，使用肥料均為尿素、復(fù)合肥(N∶P∶K=15∶15∶15,質(zhì)量比)。前茬作物為油菜。

水稻K優(yōu)082為平原地區(qū)主栽品種[16]，3個采樣地產(chǎn)量分別是10 062.0 kg/hm2、10 207.5 kg/hm2、9 100.5 kg/hm2，千粒質(zhì)量分別為31.9 g、31.2 g、31.6 g，單株有效穗數(shù)分別為17.3、16.7、16.9，每穗粒數(shù)分別為180.8、160.6、161.4，結(jié)實率分別為84.3%、85.8%、82.6%。先豐優(yōu)901為山區(qū)地區(qū)主栽水稻品種[17]，3個采樣地產(chǎn)量分別是9 762.0 kg/hm2、9 906.0 kg/hm2、9 252.0 kg/hm2，千粒質(zhì)量分別為29.7 g、29.2 g、29.4 g，單株有效穗數(shù)分別為18.1、17.4、16.2，每穗粒數(shù)分別為182.5、170.0、169.1，水稻結(jié)實率分別為86.9%、84.7%、80.7%。

1.2 水稻根際采集時間及采集方法

采集土樣時間為2015年4月至8月，具體采樣時間見表1。采用五點采樣法進(jìn)行根際樣品采集，將水稻根系從土壤中挖出，用抖落法[17]抖掉與根系松散結(jié)合的土體，然后將土壤連帶植物組織包裹帶回實驗室后進(jìn)行充分混勻，過2 mm篩。

表1 采樣時間表

1.3根際微生物的分離計數(shù)及純培養(yǎng)

稱取10 g水稻根際放入裝有100 ml無菌水的三角瓶中，150 r/min振蕩10 min，吸取5 ml至裝45 ml有無菌水的三角瓶中，制成1∶100的稀釋液,再依次制備成10-1、10-2、10-3梯度稀釋液。吸取各稀釋液100 ml至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，涂布均勻，37 ℃培養(yǎng) 14～18 h。每個稀釋梯度做3個重復(fù)。利用菌落計數(shù)器對每一個平板上的土壤細(xì)菌進(jìn)行單菌落計數(shù)，計算分離出來的土壤中的細(xì)菌數(shù)[18]。

菌落數(shù)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/干土質(zhì)量×100%

1.4 細(xì)菌16S rDNA的擴增及序列分析

用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒將細(xì)菌基因組DNA提取后，用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行16S rDNA的序列擴增。PCR反應(yīng)體系(50.00 μl)為：10×Buffer 5.00 μl、2.5 mmol/L Dntp 5.00 μl、上下游引物各2.00 μl、模板1.00 μl、Taq酶0.25 μl，加水至50.00 μl。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，終止PCR反應(yīng)。采用0.8%瓊脂糖對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并送上海英駿測序公司測序。

測序完成后，對所有菌株進(jìn)行 16S rDNA序列測定。測序結(jié)果利用BLAST軟件(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析，初步確定分離得到菌的種屬。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

選取同源性最高且有效發(fā)表的菌株序列，利用 MEGA5.1 軟件(http：//www.megasoftware.net/mega5.1.html)進(jìn)行分析，用 Clustal W 按照最大同源性的原則進(jìn)行排序，采用Kimura-2 計算核苷酸差異值，最后用鄰接法(Neighbor-Joining method)[19]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻根際細(xì)菌的數(shù)量變化

對3個地區(qū)根際細(xì)菌菌落數(shù)的統(tǒng)計(圖1)發(fā)現(xiàn)，在溶液稀釋10倍和100倍的條件下，漢濱和城固地區(qū)K優(yōu)082的根際細(xì)菌菌落數(shù)大于先豐優(yōu)901，寧強地區(qū)則相反。這可能是由于平原主栽品種K優(yōu)082在平原地區(qū)(漢濱和城固)生長狀態(tài)更好，與根際微生物互作關(guān)系更強，能夠被分離得到更多的細(xì)菌，而山地主栽品種先豐優(yōu)901則在山地(寧強)地區(qū)更有生長優(yōu)勢。這說明，水稻品種及地理位置對水稻根際細(xì)菌數(shù)量有顯著影響，這與黃柳琴等[20]、厲桂香等[21]的研究結(jié)果較為一致。稀釋1 000倍的土壤溶液中可培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量均較小，不能進(jìn)行比較和分析。

分析曲線變化可以發(fā)現(xiàn)，在五葉期的10倍和100倍根際土壤稀釋液中分離得到了較多的細(xì)菌菌落，且其數(shù)量較其他兩個時期有顯著差異。這一現(xiàn)象均出現(xiàn)在3個采樣地的2個水稻品種根際土壤細(xì)菌分離過程中?？梢猿醪酵茢啵究赡茉谖迦~期與微生物互作更為緊密，分蘗期次之，孕穗期最差。這可能與水稻生長特性相關(guān)，隨著水稻的生長發(fā)育，土壤含水量逐漸升高，導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量下降[22]。

圖1 細(xì)菌菌落數(shù)變化趨勢圖Fig.1 The variation tendency of bacterial colony

2.2 水稻根際土壤細(xì)菌組成

對分離獲得具有明顯差異的單菌落進(jìn)行DNA提取及16S rDNA擴增，每個采樣地的每個水稻品種3個時期的根際細(xì)菌單菌落均篩選出 70株細(xì)菌。從圖2中可以看出，提取的DNA較為完整，擴增后得到約為1 500 bp的細(xì)菌16S rDNA條帶，可保證后續(xù)測序結(jié)果的完整性。

每個采樣地的每個品種在每個時期均成功進(jìn)行了62個測序，通過對測序結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，水稻根際中共檢測出4個門，分別為擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)。其中，厚壁菌門為優(yōu)勢菌種，在每個采樣點所占比例均超過70%，在漢濱采樣地的水稻分蘗期先豐優(yōu)901的根際細(xì)菌均屬于厚壁菌門。從圖3中還可以發(fā)現(xiàn)，隨著水稻的生長發(fā)育，厚壁菌門所占比例也逐漸上升，在分蘗期達(dá)到最高峰，又在孕穗期下降。變形菌門在所有的五葉期和孕穗期的根際中均能發(fā)現(xiàn)。

A圖和B圖中M代表Maker，用來指示條帶長度，為康為世紀(jì)的100 bp ladder,貨號為CW0636M。A圖中1～6代表6個不同的細(xì)菌菌液提取出來的基因組DNA,B圖中1～6代表6個細(xì)菌基因組DNA經(jīng)過PCR擴增出來的16S DNA條帶。圖2 水稻根際細(xì)菌基因組DNA提取(A)及細(xì)菌16S rDNA擴增圖(B) Fig.2 Results of DNA(A) and 16S rDNA(B) on soil bacteria form rice rhizosphere

a:K優(yōu)082-五葉期；b：先豐優(yōu)901-五葉期；c：K優(yōu)082-分蘗期；d：先豐優(yōu)901-分蘗期；e：K優(yōu)082-孕穗期；f：先豐優(yōu)901-孕穗期。圖3 水稻根際細(xì)菌組成Fig.3 The group of bacteria in rice rhizosphere soil

進(jìn)一步從屬的角度分析，從圖4中可以看出：首先，在分析的所有根際樣本中，共有26個屬，1～26分別為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)、節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)、根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenessp.)、腸桿菌屬(Enterobactersp.)、泛菌屬(Pantoeusp.)、不動桿菌屬(Acinetobactesp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)、嗜冷桿菌屬(Psychrobactersp.)、鞘氨醇菌屬(Sphingobacteriumsp.)、Lysinibacillusvarians、弗拉托氏菌屬(Frateuriasp.)、Fictibacillus、黃單胞菌屬(Xanthomonassp.)、巴斯德菌屬(Pasteurellasp.)、噬氫菌屬(Hydrogenophagaatypica)、梭菌屬(Fusiformis)、Terribacillus、叢毛單胞菌屬(comamonas sp.)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacteriumsp.)、阪崎腸桿菌屬(Cronobactersp.)、氣單胞菌屬(Aeromonassp.)和嗜氮根瘤菌屬(Azorhizophilussp.)。其中，枯草芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌，其在除漢濱地區(qū)K優(yōu)082的五葉期根際樣本(枯草芽孢桿菌屬細(xì)菌占總菌數(shù)的64.52%)以外的所有根際樣本中所占比例均超過80.00%，最高甚至達(dá)到98.39%(寧強采樣地的K優(yōu)082在孕穗期的根際樣本)。

其次，3個采樣地的2個水稻品種在五葉期的根際樣本中細(xì)菌豐度最好，這一結(jié)論也與本研究關(guān)于細(xì)菌計數(shù)及細(xì)菌組成分布的結(jié)論一致。因此，五葉期水稻與土壤及根際微生物互作最為顯著。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

根據(jù)測序結(jié)果對所有分離得到的細(xì)菌進(jìn)行了統(tǒng)一歸類，對獲得的細(xì)菌DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，選擇一些與測定序列同源性較高的抑制種序列作為參考序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果(圖5)表明，在所有土壤樣本中，共得到66個不同的細(xì)菌種，枯草芽孢桿菌屬為優(yōu)勢細(xì)菌類群。

圖4 3個采樣地不同水稻生長時期根際細(xì)菌多樣性變化趨勢Fig.4 The diversity trends of bacteria in rhizosphere soil in different rice growth period

圖5 基于16S rDNA的水稻根際細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of bacteria in rice rhizosphere soil based on 16S rDNA

3 討 論

本研究主要針對西北水稻主產(chǎn)地——陜西南部地區(qū)，對不同生長發(fā)育時期，2個水稻品種的根際微生物組成進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，從所有根際樣本中共分離得到了26個屬的細(xì)菌，分別劃歸于4個門。其中厚壁菌門的細(xì)菌占大多數(shù)，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬。本研究數(shù)據(jù)對構(gòu)建陜南土壤微生物數(shù)據(jù)庫提供了基礎(chǔ)試驗數(shù)據(jù)。同時，試驗還發(fā)現(xiàn)了一些其他具有一定研究價值的菌屬，比如前人研究較少，具有良好抗鹽效果的Terribacillus屬[23]，將會在后續(xù)研究中繼續(xù)進(jìn)行探索。

本研究還對不同生長階段的細(xì)菌多樣性變化趨勢進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個水稻品種根際細(xì)菌均在五葉期的多樣性最強，隨后逐漸降低，但分蘗期和孕穗期差異不大。這說明，與分蘗期和孕穗期相比，五葉期水稻與根際細(xì)菌互作更為頻繁。這就意味著，在下一步研究輪作制狀態(tài)下水稻與根際微生物互作關(guān)系時選擇五葉期更為合適。

本研究僅采用牛肉膏蛋白胨單一培養(yǎng)基分別對水稻根際細(xì)菌進(jìn)行分離研究，初步揭示了陜南油菜-水稻輪作制下，水稻根際特有生境中微生物種群的組成特征，但仍然存在一定的局限性。有必要采用不依賴純培的分子生物學(xué)方法，以獲取更全面的水稻根際微生物多樣性信息。

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