尚婧曄 郁濤 鄒晏 李黎 劉陽

(四川省疾病預防控制中心，四川 成都 610041)

瘧疾是嚴重危害人類身體健康和生命安全，影響流行區(qū)社會經濟發(fā)展的全球性重要蟲媒傳染病[1-3]。四川省曾經是全國瘧疾疫情最嚴重的地區(qū)之一，最高感染率達87.4/萬，發(fā)病人數一度超過50多萬[4-5]。建國以來，經過半個世紀的努力，四川省瘧疾防治工作取得了顯著成效，流行范圍逐步減小，人群發(fā)病率逐漸降低，2010年全省瘧疾防治工作正式進入消除階段，自2011年起已連續(xù)7年無本地感染病例報道[5-8]。盡管如此，瘧疾仍然是目前四川省最重要的公共衛(wèi)生問題之一。近年來，隨著赴境外務工人數的不斷增加，輸入性瘧疾病例數不斷增加，并持續(xù)出現(xiàn)死亡病例，輸入性瘧疾形勢異常嚴峻[8]。在現(xiàn)階段新發(fā)病例少、感染程度低、用藥普遍、輸入性為主的防控新形勢下，如何提升早期、藥后低密度瘧原蟲檢測能力，實現(xiàn)及時診斷，準確鑒別本地、輸入、變異病例，控制繼發(fā)性感染，防止疫情爆發(fā)，是目前瘧疾防控面臨的重要難題。

本研究以人工模擬制成不同濃度梯度的間日瘧原蟲血片，通過優(yōu)化DNA提取前處理方法，結合巢式PCR擴增，測定其最低檢出限，探索巢式PCR用于低密度瘧原蟲血片DNA檢測的可行性，為瘧疾低度感染病例提供行之有效的早期診斷方法，并為下一步探索區(qū)分本地流行與輸入性、變異性瘧疾提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及試劑、設備 感染性血液樣本保存于四川省疾病預防控制中心瘧疾診斷參比實驗室，來源為1例2014年廣安市岳池縣間日瘧死亡病例，經四川省疾控中心專家鏡檢、PCR復核，確認為高密度間日瘧原蟲感染血樣。稀釋用血樣保存于四川省疾控中心門診，來源為健康人抗凝血。DNA抽提試劑盒(QIAamp DNAMini Kit)購自德國Qiagen公司，2×Power Taq PCR Master Mix以及引物購自成都擎科生物技術有限公司，DNA標志物購自寶生物工程(大連)有限公司，核酸染料購自北京索萊寶科技有限公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest公司，甲醇、無水乙醇和二甲苯購自國藥集團化學試劑有限公司，吉氏色素購自成都市科龍化工試劑廠，2.58%的吉氏染料自制備用。DNA自動提取采用Qiagen核酸純化儀QIAcube。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度梯度間日瘧原蟲血片的制備 將具有較高密度的原始間日瘧原蟲抗凝血血樣常溫放置溶解，觀測無血凝塊后，采用健康人抗凝血作為稀釋液，按照1：10、1：100、1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000對原濃度血樣進行稀釋，制成9個濃度梯度血樣。每個濃度同時制作2張標準血片，厚血膜、薄血膜分別以5ul、2ul進行定量制作，采用吉氏染色法染色。原樣標準血片標記為O，其余血樣片按照稀釋度的增加依次標記為A、B、C、D、E、H。

1.2.2 血片鏡檢 每張血片同時由兩名具有豐富經驗的瘧原蟲鏡檢專家進行顯微鏡觀察，確定每一濃度所有血片的鏡下計數結果。鏡檢計數方法采用由WHO推薦的白細胞瘧原蟲計算公式：瘧原蟲數÷白細胞數×每uL血中白細胞數= 瘧原蟲數/uL血。此計算公式若用于無法進行白細胞計數的樣本，則以國際標準按8000個/mL血白細胞進行計算。厚血膜檢查200個油鏡視野，若未發(fā)現(xiàn)瘧原蟲則記為陰性[9]，當某一濃度2張血片都為陰性時,該濃度的上一濃度即作為間日瘧瘧原蟲的顯微鏡檢出限。

1.2.3 DNA提取

1.2.3.1 所有濃度血片在鏡檢后進行一次簡單的脫片晾干。

1.2.3.2 根據文獻報道[10]，采用DNA試劑盒改良法，在厚血膜表面滴1～2滴預熱的ATL裂解液，用無菌手術刀片將整個血膜刮下，使其全部與ATL液混合后加入無菌2 ml EP管底。薄血膜直接采用無菌手術刀片緩慢刮取，最后滴上ATL裂解液混合加入EP管底。

1.2.3.3 所有樣本漩渦震蕩10s，8000×g離心l min，加入適量ATL裂解液，85℃孵育10min。根據DNA抽提試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)操作步驟設置程序，將樣本放入核酸自動提取儀中進行DNA自動提取。

1.2.4 巢式PCR擴增

1.2.4.1 參照文獻設計引物[11-12](根據瘧原蟲SSU rRNA基因保守區(qū)所設計的PCR引物)進行巢氏PCR擴增。rPLU5和rPLU6為瘧原蟲屬特異性引物，RVIV為間日瘧原蟲(P. vivax)種特異性引物。引物由成都擎科生物科技有限公司合成，具體引物序列和預期片段長度,見表1。

表1 瘧原蟲特異性引物 Table 1 Specific primers

1.2.4.2 反應體系 2 ×Master Mix 10μl， 上、下游引物(10 μmol/L) 各1μl， DNA模板2μl，ddH2O6μl，總反應體積20μl。

1.2.4.3 反應條件 第1 輪94 ℃3 min； 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃90 s， 共34個循環(huán)， 72 ℃ 5 min。第2輪94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 60 s， 共34個循環(huán)， 72 ℃5 min。

1.3 電泳檢測 取10μl第2輪PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 測序比對 第2輪PCR產物送往成都擎科生物有限公司測序，結果上傳NCBI進行Blast比對分析。

2 結果

2.1 血片鏡檢 由2名具有豐富經驗的瘧原蟲鏡檢專家鏡下觀察計數，在第3個稀釋度后鏡檢結果均為陰性，即1:100為瘧原蟲血片的顯微鏡檢出限,見表2。

表2 不同濃度梯度檢出限匯總表 Table 2 The detection threshold for P. vivax

2.2 巢式PCR擴增 經過巢氏PCR擴增、瓊脂糖電泳，瘧原蟲血片薄血膜、厚血膜分別在第3個和第8個稀釋度后檢出均為陰性，即瘧原蟲血片薄血膜檢出限為1:100，厚血膜檢出限1:16000，見圖1、表2。

2.3 測序和序列比對結果 第二輪PCR擴增產物經測序、blast比對，結果顯示產物序列與GenBank中已登記的間日瘧原蟲參考序列一致性為100%，見圖2。

圖1 PCR擴增結果 Figure 1 PCR results

注：1-1：薄血膜提取DNA PCR擴增結果；1-2：厚血膜提取DNA PCR擴增結果。O：原樣； A：1：10稀釋度；B：1：100稀釋度；C：1：1000稀釋度；D：1：2000稀釋度；E：1：4000稀釋度；F：1：8000稀釋度；G：1：16000稀釋度；H：1：32000稀釋度；M：DNA標志物；NTC：無模板對照；PC：陽性對照

圖2 核酸序列比對圖 Figure 2 The alignment of nucleotide sequence

3 討論

近年來隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，以巢式PCR為代表的分子生物學方法開始逐漸被應用于瘧疾的實驗室檢測中[13-17]。盡管顯微鏡下觀察、鑒別、計數作為病原學的經典方法目前仍被視為金標準廣泛應用于瘧疾診斷，但在當下已進入瘧疾消除階段，流行程度普遍較低，感染程度往往較輕的情況下，對于早期僅含有較低密度病原的無癥狀或癥狀較輕的患者，以及已服用抗瘧藥物的患者，若僅采用顯微鏡觀察，顯然具有較大的局限性，難以進行及時診斷并實現(xiàn)準確鑒別，極易造成漏診。本次研究結果表明，巢式PCR檢測間日瘧原蟲血片厚血膜提取DNA的檢出限為0.8個蟲/μl血，符合此前Scopel等[18]的報道結果——厚血膜中瘧原蟲密度小于20個/μl時，巢式PCR依然能夠擴增出陽性條帶——相較之下本次檢出靈敏度更高，更遠低于顯微鏡檢出限132個/ul血。薄血膜DNA的提取與擴增效果相對較差，其檢出限與鏡下檢查水平一致，這可能與薄血膜涂制血量少，涂布面大而導致血片刮取樣本耗損多，以及血片鏡檢后進行過一次脫片有關。總的來說，相較于鏡下觀察，基于DNA提取的巢式PCR技術作為顯微鏡檢查的有效補充方法之一，靈敏度顯著提升，對于低密度瘧原蟲感染診斷具有較高的應用意義。

PCR的擴增效果取決于多種因素，其中從樣本中提取到的DNA濃度和質量是決定PCR成功與否及其檢出靈敏度的關鍵因素。李軻[19]等報道以血樣直接提取DNA為樣本進行巢式PCR擴增，最低可檢出達到0.0856個蟲/ul血，檢出靈敏度相較于以血片為載體、從血膜中提取DNA為樣本的本次研究結果高出近一個數量級，其原因一方面在于全血樣本可用于提取DNA的血樣量大，提取病原總量較多(同等密度下)，另一方面可能與血片取膜時具有一定損耗有關。盡管全血樣用于瘧原蟲DNA的提取效果較佳，尤其是在病原密度較低的情況下，但其運輸條件相對復雜，且無法長期保存，難以滿足現(xiàn)階段瘧疾多項目檢測并行的需求。血片作為瘧疾樣本檢測、保存最主要、最常見的載體之一，具有制作所需血量小、價格低廉、可長久保存的特點，長期以來被廣泛應用于各級檢測機構，也是多數早期瘧疾病人現(xiàn)有留存的唯一樣本證據。從血片中提取瘧原蟲DNA具有較大的困難性，尤其是對于年代已久的陳舊血片，因早年制作不規(guī)范，保存條件不當，加上經過染色、反復洗脫、復染而導致留存瘧原蟲處于較低密度狀態(tài)[20]。本次研究結果顯示，通過改進前處理方法結合巢式PCR擴增可從血片中成功檢出瘧原蟲，尤其是厚血膜，在較低密度下仍可獲得較高質量的核酸，證實了血片應用于瘧疾的分子生物學檢測的可行性，為提取陳舊性血片中瘧原蟲DNA用于回顧性研究不同階段瘧疾防治進程中瘧原蟲基因型和多態(tài)性變化，以實現(xiàn)病例來源(本地、輸入、變異)追溯提供了實驗基礎。本次研究結果也提示我們，在血片薄血膜的DNA提取方法上還有待進一步的探索和提高，嘗試耗損更小、精確度更高的DNA提取方法。

值得注意的是，盡管制成的血片可以固定瘧原蟲蟲體，但在其長期保存與反復用于鏡檢的過程中，仍然存在部分蟲體發(fā)生變形、裂解，在鏡下難以識別辨認的可能，造成鏡檢計數低于實際感染水平的情況，而類似狀況在在現(xiàn)實工作中實際普遍存在。不同于依賴形態(tài)鑒別為手段的顯微鏡檢查，以DNA為模板的PCR方法更為穩(wěn)定，因為DNA在蟲體裂解后仍可長期存在，形態(tài)是否完整對其擴增并不具有太大影響，這也是造成分子生物學檢測靈敏度遠高于鏡檢的重要原因之一。為準確、定量反應血片樣本尤其是陳舊性血片樣本中瘧原蟲載量，比較顯微鏡鏡下計數與實際感染水平、巢式PCR與其它不同分子生物學方法檢測能力的差異大小，并進一步提升瘧原蟲血片中病原DNA的檢測靈敏度，本課題組后續(xù)將進一步采用qPCR方法進行相關檢測，以期獲得更為全面、準確的比對數據。

4 結論

研究結果顯示，血片作為常規(guī)檢測和保存載體，可有效應用于瘧原蟲DNA的提取，結合巢氏PCR擴增，獲得顯著高于顯微鏡的檢測水平，尤其是厚血膜檢出限達到0.8個蟲/μl血，提示以高質量DNA提取為基礎的巢氏PCR方法更適宜于作為檢測低密度感染瘧疾的有效手段。

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