陳晨 江舟 王正榮 李光明

(1.四川省科學(xué)城醫(yī)院，四川 綿陽621900；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室，四川 成都 610041； 3. 衛(wèi)生部時間生物學(xué)重點實驗室，四川 成都610041；4.南充市中心醫(yī)院，四川 南充637000)

缺血性心臟病(ischemic heart disease)是指冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管腔狹窄或閉塞，或(和)因為冠狀動脈功能性改變(即血管痙攣)所致心肌缺血缺氧，嚴重致心肌壞死而引起的心臟疾病[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)近年我國缺血性心臟病發(fā)病率逐年升高，嚴重危害人類健康的常見病[3- 4]。本病出現(xiàn)臨床癥狀或致殘、致死等多發(fā)生于40歲以后，且男性發(fā)病明顯早于女性患者。缺血性心臟病的發(fā)病機制，曾有多種學(xué)說從不同的角度加以闡述,從最早的脂質(zhì)浸潤學(xué)說，其后的平滑肌細胞克隆學(xué)說以及血小板聚集和血栓形成學(xué)說?，F(xiàn)在學(xué)術(shù)界傾向于1973年提出的動脈粥樣硬化形成的“損傷-反應(yīng)學(xué)說”。

近年隨著時間生物學(xué)的興起，眾多學(xué)者及臨床醫(yī)務(wù)工作者在長期的醫(yī)學(xué)實踐觀察中發(fā)現(xiàn)心肌缺血發(fā)病具有近日節(jié)律，心肌缺血的節(jié)律被認為與心肌電生理、血液流變學(xué)、自主神經(jīng)活動和冠脈血栓形成等的近日節(jié)律有關(guān)[5-7]。Maemura K等[8-9]采用酵母雙雜交技術(shù)對人臍帶血管內(nèi)皮細胞cDNA進行分析，發(fā)現(xiàn)節(jié)律基因Clif(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator like 2，CLIF)能與近日鐘基因Clock(circadian clock gene)結(jié)合形成二聚體，在內(nèi)皮細胞中Clock、Clif形成的二聚體能與血漿纖溶蛋白溶酶原激活抑制因子-1(serpin family E member 1，Pai-1)基因的E-box結(jié)合促進其上調(diào)表達產(chǎn)生Pai-1，形成近日節(jié)律，這也是心肌梗塞或心絞痛常見于早晨的關(guān)鍵因素。為進一步明確近日鐘基因在心肌缺血發(fā)生發(fā)展中的作用及機制，本研究致力于中國漢族人群中Clock基因多態(tài)性與心肌缺血的相關(guān)性研究，擬對心肌缺血患者Clock基因多態(tài)性進行多位點和多樣本綜合研究，有助于更好地了解心肌缺血發(fā)病的機制，進而為缺血性心臟病的預(yù)防提供實驗依據(jù)，對已患患者群更有針對性地制定個體化治療方案。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集2015年1月～2016年1月之間臨床確診的心肌缺血患者120例設(shè)為心肌缺血組，年齡38～84歲；同時通過臨床體檢確定為健康人群78例設(shè)為健康對照組，年齡40～75歲(樣本例數(shù)來自四川省科學(xué)城醫(yī)院、南充市中心醫(yī)院及四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部)。所有實驗標(biāo)本的收集均經(jīng)本醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員會認可并獲得患者知情同意。分別于清晨7時抽取5ml抗凝血液進行生化指標(biāo)檢測包括甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等指標(biāo)，其中3ml留作DNA分離進行基因測定?？偰懝檀?、甘油三酯及低密度脂蛋白指標(biāo)心肌缺血組明顯高于健康對照組，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而高密度脂蛋白指標(biāo)在心肌缺血組與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。心肌缺血組與健康對照組臨床資料統(tǒng)計分析，見表1。

1.2 試驗試劑和相關(guān)儀器 普通 PCR 儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司，NanoDrop 2000c 紫外分光光度計購自美國ThermoScientific公司，電熱恒溫水浴箱購自北京永光明醫(yī)療儀器廠?？?RNA 抽提試劑 Trizol 購自 Invitrogen 公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，普通PCR試劑盒(Takara EmeraldAmp PCR Master Mix)與人全基因組DNA提取試劑盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0)購自日本Takara公司。SNaPshot試劑盒購自美國ABI公司。Pai-1和血栓素(thrombomodulin，Tm)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自美國Sigma公司。近日鐘基因(clock circadian regulator，Clock)干擾試劑盒購自中國上海吉瑪公司。

Table2Comparisonofgeneralandbiochemicalindexesofmyocardialischemiagroupandhealthycontrolgroup

組別心肌缺血組(n=120)健康對照組(n=78)P年齡 (歲)67.2 ± 8.959.8 ± 10.00.022①性別 (女/男)49/7145/330.021①總膽固醇(mmol/L)4.49 ± 1.032.84 ± 0.760.005①甘油三酯(mmol/L)1.92 ± 1.561.23 ± 0.660.002①高密度脂蛋白(mmol/L)1.91 ± 0.851.36 ± 0.310.170低密度脂蛋白(mmol/L)3.75 ± 0.882.78 ± 0.63<0.001①

注：與健康對照組比較，①P<0.05

1.3 方法

1.3.1 人全基因組DNA的提取 選取-80℃保存的血細胞，依照Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒說明書，提取各標(biāo)本中的全基因組DNA，之后使用NanoDrop 2000c 紫外分光光度計測定所提取每個樣本的全基因組濃度，并放于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 小鼠總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 收集各組小鼠的血漿，按照 RNA 抽提試劑盒說明書抽提總 RNA。用NanoDrop 2000c 紫外分光光度計對提取的總RNA 進行定量后，取1 ug總RNA按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(reverse transcription，RT )。

1.3.3 普通PCR反應(yīng) 按照Takara EmeraldAmp PCR Master Mix試劑盒進行普通PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：PCR Master Mix 10μL，正、反向引物(10 μmol )共2.0μL，模板1μL，滅菌水7μL，引物序列(見表2)。PCR 擴增條件如下：98℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共37個循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃冷卻30 min，反應(yīng)結(jié)束后置4℃保存。隨后采用1.5 %瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物大小，取出凝膠在凝膠成像系統(tǒng)記錄并鑒定提取結(jié)果。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 采用雙抗體夾心法測定人群和小鼠血漿中PAI-1和血栓素(TM)蛋白含量的變化表達水平。主要原理如下：用純化的一抗包被微孔板，制成固相抗體，往微孔中加入血清，再加入與酶標(biāo)記過的二抗結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加顯色劑顯色。

表2 基因引物序列信息 Table 2 Sequence information of gene primers

1.3.5 RNA干擾技術(shù) C57BL/6J 小鼠購自南京動物模式研究，參照Clock干擾試劑盒，采用小鼠尾靜脈注射干擾物，沉默小鼠Clock基因的表達，并采用RT-PCR測定小鼠血漿Clock mRNA的表達水平變化。

1.3.6 單堿基引物延伸法基因分型(SnapShot) 按照SnapShot試劑盒進行反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：PCR產(chǎn)物總體積9μL，Exol酶0.1μL，SAP buffer 0.1μL，SAP 2μL，加滅菌水至總體積12μL。反應(yīng)條件：37℃ 1 h；75℃ 15min。隨后進行單堿基引物延伸，反應(yīng)體系：純化后產(chǎn)物1μL，SNapShot Multiplex 1μL，SnapShot primer 0.2μL，加滅菌水至至總體積5μL。反應(yīng)條件：96℃ 預(yù)變性1min；96℃變性10 sec，50℃退火5 sec，60℃延伸30 sec，共25個循環(huán)。隨后采用1 %瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物大小，取出凝膠在凝膠成像系統(tǒng)記錄并鑒定提取結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者Clock基因多態(tài)性位點基因型及等位基因頻率分布比較Clock基因rs3840267位點的基因型及等位基因頻率分布，在心肌缺血組和健康對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而rs3749474和rs1402963位點基因型及等位基因頻率分布，在心肌缺血組和健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組患者Clock基因多態(tài)性位點基因型及等位基因頻率分布比較[n(×10-2 )] Table 3 Comparison of genotype and allele frequency distribution of Clock gene polymorphic loci in myocardial ischemia group and healthy control group

注：與健康對照組相比，①P<0.05

2.2 兩組Clock基因rs3840267位點基因型及等位基因頻率分布在不同性別之間的比較 心肌缺血組與健康對照組中Clock基因rs3840267位點的基因表型和等位基因分頻率分布在心肌缺血組與健康對照組中不同性別之間的比較，發(fā)現(xiàn)，在女性組中心肌缺血組AA和A型顯著性的低于健康對照組(P<0.05)，見表4、表5。

表4Clock基因rs3840267位點基因型及等位基因頻率分布在兩組中男性人群的比較[n(×10-2)]

Table4ComparisonofgenotypeandallelefrequencydistributionofClockgeners3840267lociinthemalegroupofmyocardialischemiagroupandhealthycontrolgroup

組別心肌缺血組健康對照組P風(fēng)險比(95%可信區(qū)間)AA54(87.10)27(87.10)11A-8(12.90)4(12.90)-0(0.00)0(0.00)A116(93.55)58(93.55)11-8(6.45)4(6.45)

表5Clock基因rs3840267位點基因型及等位基因頻率分布在兩組中女性人群的比較[n(×10-2)]

Table5ComparisonofgenotypeandallelefrequencydistributionofClockgeners3840267lociinwomenwithmyocardialischemiaandhealthycontrols

組別心肌缺血組健康對照組P風(fēng)險比(95%可信區(qū)間)AA33 (78.57)39 (97.50)0.009①10.638(1.280～88.379)A-9 (21.43)1 (2.50)-0 (0.00)0 (0.00)A75 (89.29)79 (98.75)0.011①9.480(1.173～76.646)-9 (10.71)1 (1.25)

注：與健康對照組相比，①P<0.05

3 討論

心血管系統(tǒng)廣泛存在著近日節(jié)律的變化，無論是心率、血壓、心功能、心肌收縮力等均呈現(xiàn)出近日節(jié)律變化的規(guī)律，這些節(jié)律存在是由近日節(jié)律鐘基因的存在通過其自激振蕩而調(diào)控心血管系統(tǒng)而形成的心血管系統(tǒng)的近日節(jié)律[10-12]。通常心血管系統(tǒng)的近日節(jié)律變化的規(guī)律可反映出心血管系統(tǒng)正常與否。近日鐘基因的表達正常與否可直接影響心血管系統(tǒng)的生物節(jié)律，如clock基因敲除小鼠不但引起自發(fā)活動的近日節(jié)律的變化，亦導(dǎo)致代謝和心率等變化，甚至造成生長發(fā)育和腫瘤等疾病的發(fā)生[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)節(jié)律基因Clock可能為中國漢族人群高脂血癥相關(guān)基因[16]。而導(dǎo)致高脂血癥冠狀動脈硬化出現(xiàn)心肌缺血癥狀。

本研究提示Clock基因rs3840267位點與中國漢族人群心肌缺血存在關(guān)聯(lián)性。通過細胞水平和動物實驗研究，采用RNA干擾技術(shù)沉默小鼠體內(nèi)clock基因表達，發(fā)現(xiàn)其血漿中Pai-1和Tm表達明顯下調(diào)。PAI-1 和TM 是在凝血機制和血栓形成中發(fā)揮著重要作用的因子。PAI-1是一種單鏈糖蛋白，當(dāng)其以活性狀態(tài)存在于血漿中時與血漿波基結(jié)合素結(jié)合，形成復(fù)合物提高其穩(wěn)定性，當(dāng)PAI-1活性存在時能有效的發(fā)揮其生理機能，降低血液的凝血傾向及血栓形成，防止血液在血管內(nèi)形成血栓[17-18]。TM是位于血管內(nèi)皮細胞膜表面的糖蛋白，它具有清除凝血酶、活化血液中抗凝因子蛋白C 的作用，在抗凝因子蛋白C 等的協(xié)同作用下能促進纖維蛋白的溶解從而降低血栓形成等作用[19-20]。當(dāng)PAI-1和TM二者的功能失調(diào)時，將導(dǎo)致血凝和抗血栓功能失調(diào)，特別是PAI-1和TM的基因表達下調(diào)時，引起表達產(chǎn)生的PAI-1和TM 減少，會造成抗凝血功能減弱，在血管中易形成血栓。正常情況下，PAI-1和TM的基因?qū)儆阽娍鼗?，即二者的表達受到Clock的調(diào)控。當(dāng)Clock基因表達異常時，特別是基因發(fā)生改變，如SNP等變異后，表達產(chǎn)生的Clock對PAI-1和TM基因調(diào)控功能受到影響，主要是造成Pai-1和Tm表達下調(diào)，生成的PAI-1和TM量下降，從而引起抗凝血功能下降，血管中的血液容易形成血栓。

通常情況下，Clock基因SNP變化是不足以引起近日節(jié)律的完全消失，但是能造成如PAI-1和TM等鐘控基因的表達下調(diào)，造成血管中的血液易形成血栓；而Clock基因近日節(jié)律仍存在在凌晨自身表達下將形成的CLOCK亦下降，結(jié)果造成患者在清晨形成血栓傾向升高，導(dǎo)致冠脈血管狹窄，易出現(xiàn)清晨心絞痛發(fā)作，甚至發(fā)生血管完全被血栓阻塞致心肌梗塞等近日節(jié)律特征的變化。

4 結(jié)論

本研究顯示，通過對Clock基因多態(tài)性與心肌缺血的關(guān)聯(lián)性研究，發(fā)現(xiàn)Clock基因rs3840267位點多態(tài)性與心肌缺血存在關(guān)聯(lián)。該研究為缺血性心臟病的防治提供了更進一步的實驗依據(jù)。

【參考文獻】

[1]Haude M.Management of Valvular Heart Disease: Esc/Eacts Guidelines 2017[J]. Herz,2017,42(8): 715-720.

[2]Maheshwari V, Barr B, and Srivastava M. Acute Valvular Heart Disease[J]. Cardiol Clin,2018,36(1): 115-127.

[3]Timmis A, Townsend N, Gale C,etal. European Society of Cardiology: Cardiovascular Disease Statistics 2017[J]. Eur Heart J,2017,38(2): 74-98.

[4]Auer R, Sidney S, Goff D,etal. Lifetime Marijuana Use and Subclinical Atherosclerosis: The Coronary Artery Risk Development in Young Adults (Cardia) Study[J]. Addiction,2017,112(11): 1904-1912.

[5]von Schantz M. Phenotypic Effects of Genetic Variability in Human Clock Genes on Circadian and Sleep Parameters[J]. J Genet,2008,87(5): 513-519.

[6]Hardin PE. The Circadian Timekeeping System of Drosophila[J]. Curr Biol,2005,15(17): 714-722.

[7]Mignot E, Takahashi JS. A Circadian Sleep Disorder Reveals a Complex Clock[J]. Cell,2007,128(1): 22-23.

[8]Maemura K, de la Monte SM, Chin MT,etal. Clif, a Novel Cycle-Like Factor, Regulates the Circadian Oscillation of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Gene Expression[J]. J Biol Chem,2000,275(47): 36847-36851.

[9]Maemura K, Layne MD, Watanabe M,etal. Molecular Mechanisms of Morning Onset of Myocardial Infarction[J]. Ann N Y Acad Sci,2001,947(12): 398-402.

[10] Fontenot MR, Berto S, Liu Y,etal. Novel Transcriptional Networks Regulated by Clock in Human Neurons[J]. Genes Dev,2017,31(21): 2121-2135.

[11] Wang Y, Ni X, Yan J,etal. Modeling Transcriptional Co-Regulation of Mammalian Circadian Clock[J]. Math Biosci Eng,2017,14(5-6): 1447-1462.

[12] Olliac B, Ouss L, Charrier A. Suicide Attempts in Children and Adolescents: The Place of Clock Genes and Early Rhythm Dysfunction[J]. J Physiol Paris,2017,110(4): 461-466.

[13] El-Athman R, Genov NN, Mazuch J,etal. The Ink4a/Arf Locus Operates as a Regulator of the Circadian Clock Modulating Ras Activity[J]. PLoS Biol,2017,15(12): 2002940.

[14] Bering T, Carstensen MB, Rath MF. Deleting the Arntl Clock Gene in the Granular Layer of the Mouse Cerebellum: Impact on the Molecular Circadian Clockwork[J]. J Neurochem,2017,142(7): 841-856.

[15] Sun Q, Zhao Y, Yang Y,etal. Loss of the Clock Protein Per2 Shortens the Erythrocyte Life Span in Mice[J]. J Biol Chem,2017,292(30): 12679-12690.

[16] 鄒晏，劉陽，魯芳，等. 中國漢族人群近日鐘基因與高脂血癥的關(guān)聯(lián)[J]. 西部醫(yī)學(xué)，2014，26(12): 1574-1580.

[17] Oishi K, Ohkura N, Yasumoto Y,etal. Circadian Fluctuations in Circulating Plasminogen Activator Inhibitor-1 Are Independent of Feeding Cycles in Mice[J]. Chronobiol Int,2017,34(2): 254-259.

[18] Oishi K, and Ohkura N. Chronic Circadian Clock Disruption Induces Expression of the Cardiovascular Risk Factor Plasminogen Activator Inhibitor-1 in Mice[J]. Blood Coagul Fibrinolysis,2013,24(1): 106-108.

[19] Cheng S, Jiang Z, Zou Y,etal. Downregulation of Clock in Circulatory System Leads to an Enhancement of Fibrinolysis in Mice[J]. Exp Biol Med (Maywood),2011,236(9): 1078-1084.

[20] Takeda N, Maemura K, Horie S,etal. Thrombomodulin Is a Clock-Controlled Gene in Vascular Endothelial Cells[J]. J Biol Chem,2007,282(45): 32561-32567.