魏長勇,余敏靈

（樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川樂山 614000）

中藥材種植及中藥飲片加工儲存過程中農(nóng)藥的不當(dāng)使用，均會影響其質(zhì)量，嚴(yán)重危害人體健康[1]。《中國藥典》2015年版四部收載了多種農(nóng)藥殘留的氣相色譜檢查方法[2],近年來，對農(nóng)藥殘留量研究報道的文獻大多以氣相、液相色譜或以其與質(zhì)譜的聯(lián)用為主[3-8],我們應(yīng)用GC-MS/MS法根據(jù)色譜保留時間和質(zhì)荷比信息對樣品進行定性分析，以樂果二級離子掃描色譜峰(125.0/79.0)面積為參照，計算其與敵敵畏二級離子掃描色譜峰（185.0/93.0）面積和毒死蜱二級離子掃描色譜峰（313.9/257.9）面積的校正因子，建立GC-MS/MS測定山藥[9]中樂果等三種農(nóng)藥殘留的一測多評方法，收到了滿意的結(jié)果，現(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下，以期為GC-MS/MS測定農(nóng)藥殘留量提供一測多評[10-12]研究思路。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

GCMS-TQ8030氣質(zhì)聯(lián)用儀(島津中國科技有限公司)；Rxi-5SilMS，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm毛細(xì)管柱，工作站為LabSolutionsGCMSSolutions版本4.20(島津中國科技有限公司);Cleanert TPH凈化柱(天津博納艾潔爾公司)。

樂果、敵敵畏、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品溶液（規(guī)格：100μg·mL-1，批 號 ：樂 果 GSB05-2286-2016,敵 敵 畏GSB05-2298-2016,毒死蜱 GSB05-1849-2016，農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測保護研究所）。乙腈、丙酮均為色譜純，氯化鈉、無水硫酸鈉均為優(yōu)級純。山藥樣品由四川龍馬藥業(yè)有限公司提供，按《中國藥典》2015年版一部鑒定為山藥（Dioscoreae Rhizoma），批號分別為20160527、20160602、20170613。

1.2 方法

1.2.1 測定原理

以樂果為對照品，利用樣品色譜圖中樂果色譜峰和敵敵畏色譜峰、毒死蜱色譜峰相對保留時間進行定位[2]；二級離子碎片圖譜中樂果在47、62、79有碎片離子峰(豐度比為155∶13∶100，以79為參比)，敵敵畏二級離子碎片圖譜中在63、93、109有碎片離子峰(豐度比為24∶100∶25，以93為參比)，毒死蜱二級離子碎片圖譜中在194、258、286有碎片離子峰(豐度比為24∶100∶49，以258為參比)；通過定位和二級離子碎片圖譜碎片離子峰以及其豐度比對樂果、敵敵畏、毒死蜱色譜峰進行定性分析。在定量分析時，通過精密量取樂果、敵敵畏、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品溶液各適量，配制成不同濃度的混合溶液，按設(shè)定條件進樣，記錄色譜圖，繪制樂果、敵敵畏、毒死蜱進樣量對其峰面積的回歸曲線，以樂果回歸曲線斜率與敵敵畏、毒死蜱回歸曲線斜率的比計算校正因子(fs/k=Ks/Kk)，通過樂果回歸曲線計算樂果含量，通過校正因子及樂果回歸曲線計算敵敵畏、毒死蜱含量。

1.2.2 測定條件

采用Rxi-5SilMS，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm毛細(xì)管柱，進樣口溫度：250℃；線速度：47.2cm/sec；程序升溫：50℃保持1 min，以25℃/min速率升至125℃，再以10℃/min速率升至300℃，保持15 min。進樣體積：1 μL。載氣：高純氦氣(＞99.999%)。

離子源溫度200℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時間5 min；碰撞氣氬氣（純度大于99.999%）；電離方式見表1。

表1 電離方式

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的制備

精密量取樂果、敵敵畏、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（每1 mL含樂果、敵敵畏、毒死蜱各10 μg）。

1.2.4 樣品溶液的制備

分別取三個批號山藥樣品（批號為20160527、20160602、20170613）約50 g，粉碎成粉末（過三號篩），分別取粉末約1 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，15 000r/min勻漿提取1 min，加入2 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，4 200 r/min離心5 min，取上清液于150 mL雞心瓶中，再于離心管中加入15 mL乙腈，按上述方法重復(fù)勻漿提取一次，合并提取液，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL。Cleanert TPH固相萃取柱上加入約2 cm無水硫酸鈉，用10 mL正己烷-丙酮(6∶4)預(yù)洗后，將樣品濃縮液移入柱中，用25 mL正己烷-丙酮(6∶4)洗脫，收集洗脫液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用丙酮定容至1 mL，0.2 μm濾膜過濾，即得。

1.2.5 樣品加標(biāo)溶液的制備

精密稱取山藥粉末1.020 1 g，按1.2.4項下樣品溶液的制備方法，從“置50 mL離心管中起到收集洗脫液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干”，加標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液5 μL，用丙酮定容至1 mL，0.2 μm濾膜過濾，即得。

1.2.6 專屬性試驗

精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液250 μL至5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。按1.2.2項下測定條件，取對照品溶液、樣品溶液、樣品加標(biāo)溶液分別進樣，記錄色譜圖。

1.2.7 線性關(guān)系考察

精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液50、100、200、250、300、400、500 μL，分置7個5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按1.2.2項下方法測定，以樂果二級離子掃描（125.0/79.0）峰面積A與樂果進樣量m(ng)進行線性回歸。

1.2.8 f值和t值的計算

通過以樂果回歸曲線斜率與敵敵畏、毒死蜱回歸曲線斜率的比計算校正因子（fsk=Ks/Kk），以保留時間比值計算t值。

1.2.9 精密度試驗

精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液200 μL至5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按1.2.2項下測定條件重復(fù)進樣6次，測定峰面積。

1.2.10 穩(wěn)定性試驗

取1.2.5項下樣品加標(biāo)溶液，按1.2.2項下測定條件分別在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h進樣，測定峰面積。

1.2.11 檢出限與定量限

精密量取樂果、敵敵畏和毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL,用丙酮稀釋制成樂果、敵敵畏和毒死蜱質(zhì)量濃度各為10 μg·mL-1的單一成分溶液，分別精密量取上述單一成分1、0.1、0.1 mL,置同一10 mL量瓶中定容，逐級稀釋，按1.2.2項下測定方法進樣，以信噪比（S/N）的3倍計算最低檢出限、10倍計算最低定量限。

1.2.12 回收率試驗

精密稱取1.2.4項下粉末9份，每份約1 g，分置9個50 mL離心管中，分為3組，每組3份，每組分別加標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液40 μL、50 μL、60 μL，按1.2.4項下方法制備樣品溶液，取樣品溶液按1.2.2項下測定條件分別進樣，記錄圖譜，按回歸方程A=615311 m-173計算供試品中樂果含量；按校正方程A敵敵畏=615311 mf敵敵畏/樂果-173計算敵敵畏含量，按校正方程A毒死蜱=615311 mf毒死蜱/樂果-173計算毒死蜱含量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗

在對照品溶液二級離子掃描色譜譜圖中有樂果二級離子掃描(125.0/79.0)、敵敵畏二級離子掃描(185.0/93.0)和毒死蜱二級離子掃描(313.9/257.9)色譜峰，保留時間敵敵畏5.690 min、樂果10.663 min、毒死蜱13.191 min，在樣品溶液色譜圖中沒有上述色譜峰，在樣品加標(biāo)溶液色譜圖中有和對照品溶液色譜圖中保留時間一致的樂果、敵敵畏、和毒死蜱二級離子掃色譜峰（見圖1）；對照品溶液和樣品加標(biāo)溶液的二級離子碎片圖譜中樂果在47、62、79處(豐度比：155∶13∶100，以79為參比)，敵敵畏在為63、93、109處(豐度比：24∶100∶25，以93為參比)，毒死蜱在194、258、286處(豐度比：24∶100∶49，以258為參比)，均有二級離子碎片峰（見圖2）。

圖1 二級離子掃描色譜圖

圖2 二級離子碎片圖譜

2.2 線性關(guān)系

按實驗測得樂果二級離子掃描峰(125.0/79.0)、敵敵畏二級離子掃描峰(185.0/93.0)、毒死蜱二級離子掃描峰(313.9/257.9）峰面積與各自進樣量在0.1～1 ng范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系；得回歸方程樂果為A=615 311 m-173,r=0.9 998(n=7)，敵敵畏為A=2 016 535 m-203，r=0.9 997(n=7)，毒死蜱為A=1 278 304 m-68，r=0.9 993(n=7)。

2.3 f值和t值的計算

計算得敵敵畏色譜峰峰面積和樂果色譜峰峰面積的校正因子f敵敵畏/樂果=2 016 535/615 311=3.277 3，相對保留時間t敵敵畏/樂果=5.690/10.663=0.533 6；毒死蜱色譜峰峰面積和樂果色譜峰峰面積的校正因子f毒死蜱/樂果=1 278 304/615 311=2.077 5，相對保留時間t毒死蜱/樂果=13.191/10.663=1.237 1。

2.4 精密度試驗

測得樂果、敵敵畏、毒死蜱二級離子掃描色譜峰峰面積的RSD（n=6）分別為0.3%、0.7%、0.5%。

2.5 穩(wěn)定性試驗

結(jié)果表明，在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h時測得的樂果、敵敵畏、毒死蜱二級離子掃描色譜峰峰面積變化不大，RSD分別為0.8%、1.1%、0.7%。

2.6 檢出限與定量限

結(jié)果表明，當(dāng)取質(zhì)量濃度為0.02、0.002和0.002 ng·μL-1的混合溶液進樣分析時，測得樂果、敵敵畏、毒死蜱的信噪比（S/N）分別為27.52、35.10、32.26，計算得最低檢出限（以進樣量計）：樂果為2.18×10-3ng、敵敵畏為1.71 × 10-4ng、毒死蜱為1.86×10-4ng；最低定量限（以進樣量計）：樂果為7.27×10-3ng、敵敵畏為5.70×10-4ng、毒死蜱為6.20×10-4ng。

2.7 回收率試驗

結(jié)果表明，樂果平均回收率為99.3%，RSD為1.5%，敵敵畏平均回收率為99.4%，RSD為1.4%，毒死蜱平均回收率為99.6%，RSD為1.5%。

2.8 樣品測定

樣品測定結(jié)果顯示：3批樣品未檢測出樂果殘留量、敵敵畏殘留量、毒死蜱殘留量。

3 討論

當(dāng)色譜條件有細(xì)微改變時，相對保留時間有細(xì)微變化，但在該試驗中，被測定物質(zhì)的定性主要采用二級離子碎片峰及其豐度比確認(rèn)，所以對相對保留時間的耐受性沒有進行考察。

我們對多種藥材農(nóng)藥殘留的含量測定進行了研究，發(fā)現(xiàn)由于中藥材含有多種成分，某些成分對測定會有一些干擾，所以在測定具體某一品種時應(yīng)設(shè)計具體的試驗參數(shù)，并進行相應(yīng)方法學(xué)論證。

GC-MS聯(lián)用法和GC-串聯(lián)MS（MS/MS）聯(lián)用法既具有GC的高分離效能，又具有MS可鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點，可同時快速測定樣品中多種殘留農(nóng)藥及其衍生物。

我們采用的一測多評法是以一種對照品，建立該成分與其他成分間的相對響應(yīng)因子，通過相對響應(yīng)因子來計算其他成分含量的一種質(zhì)量控制方法。該法具有成本低、效率高等優(yōu)點，能有效解決多指標(biāo)質(zhì)量控制面臨的對照品短缺、不易獲得和檢測成本相對昂貴等問題。

1. 孔令軍，張婭婷，谷令彪，等.中藥材農(nóng)藥殘留的研究進展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015,21(21):231-234.

2. 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:209-223.

3. 程志，張蓉，劉韋華，等．氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查測定中藥材中144種農(nóng)藥殘留[J]．色譜，2014,1(32):57-68.

4. 達(dá)晶，王剛力，曹進，等.農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)體系概述及其分析方法進展[J]．藥物分析雜志，2014，5(34):760-769.

5. 殷玉杰，夏秀萍，毛福英，等.藥用植物中農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的研究進展[J]．中國藥房，2017，28(12):1 271-1 275.

6. 閆震，聶繼云，徐國鋒，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對比4種凈化方式對不同色素含量基質(zhì)中19種農(nóng)藥殘留檢測的影響[J]．分析測試學(xué)報,2014,33(9)：1000-1009.

7. 國金玲，張朔生.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥品及食品分析中的應(yīng)用[J]．中國藥事，2016,30(6):560-563.

8. 劉嬌，劉雪峰，樊寶娟.GC-MS法測定18種藥材中的農(nóng)藥殘留量[J]．西北藥學(xué)雜質(zhì),2017,1(32):9-13.

9. 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:28-29.

10. 徐賽華，沈昱翔.一測多評法測定重樓藥材中4種皂苷類成分含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2017,9(36):1 029-1 033.

11. 呂邵娃，于風(fēng)明，蘇紅，等.中藥材一測多評中相對校正因子的規(guī)范性文獻調(diào)查和分析[J]．中國藥房,2016,27(15):2 020-2 023.

12. 陳楊，徐光臨，徐德生，等.一測多評法在中藥質(zhì)量中的控制及關(guān)鍵問題[J]．環(huán)球中醫(yī)藥,2017,10(5):635-640.