楊少良 牛甜甜 李明清 王海燕

(復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中西醫(yī)結合婦科,上海 200011)

復發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion,RSA)是指連續(xù)3次或3次以上于妊娠20周以前發(fā)生流產(chǎn)，在育齡期婦女中發(fā)病率約5%[1]。復發(fā)性流產(chǎn)的病因包括多個方面，除常見的父母染色體異常、抗磷脂抗體綜合征、宮腔異常等原因外，另外還有同種免疫、內分泌及環(huán)境等因素。目前關于復發(fā)性流產(chǎn)的研究眾多，但是仍有約50%以上的病例病因不明，而免疫因素可能是不明原因復發(fā)性流產(chǎn)的重要原因[2]。復發(fā)性流產(chǎn)的治療主要針對危險因素展開，包括胚胎植入前基因診斷、抗凝治療、內分泌治療和免疫治療等，傳統(tǒng)的中藥治療也是不明原因流產(chǎn)患者治療的一個重要方法。

傳統(tǒng)的中醫(yī)學認為，胎兒能在母體內正常生長發(fā)育和成熟，關鍵在于胎兒和母體相互適應。一方面需要母體腎氣充沛、氣血充實，另外一方面需要胎兒健康，能從母體獲得足夠的能量。補腎益氣方由菟絲子、桑寄生、杜仲、黨參、 白芍、白術、條黃芩、蘇梗共8味藥組成，具有補腎健脾、益氣養(yǎng)血、固胎元的作用。在既往的研究中，補腎益氣方對不明原因的復發(fā)性流產(chǎn)患者具有良好的治療作用，但具體機制仍不清楚[3,4]。本文對補腎益氣方治療復發(fā)性流產(chǎn)的機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 免疫組織化學IDO抗體購自美國R&D公司；免疫組織化學試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司；細胞流式抗體CD56、CD16、IDO購自達科為生物技術有限公司；1-甲基色氨酸(1-MT)購自Sigma-Aldrich；NK細胞分選試劑盒購自美天旎公司。顯微鏡購自日本Olympus公司;流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；滋養(yǎng)細胞細胞系HTR-8/SVneo由復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖免疫研究所提供。

1.2方法

1.2.1絨毛組織收集 該項研究已獲復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會批準和認可。所有絨毛組織標本均獲取于2015年9月至2016年11月在復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院行人工流產(chǎn)或流產(chǎn)后刮宮的患者。經(jīng)患者知情同意后，將絨毛組織在無菌條件下置入裝有無血清高糖培養(yǎng)基的離心管中，放置于冰盒內，并于1 h內帶回實驗室。絨毛組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片。外周血液樣本取自健康志愿者，用帶有肝素的針管抽取靜脈血約10 ml，用于分離NK細胞。

1.2.2外周NK細胞的分離 將外周血加入裝有淋巴細胞分離液的無菌長玻管中，外周血與淋巴細胞分離液的比例為1∶1。2 000 r/min離心20 min，吸取白膜層細胞即為外周血單個核細胞(PBMC)。按照NK細胞分選試劑盒說明書的步驟分選NK細胞，用流式細胞儀鑒定所得細胞的純度。

1.2.3免疫組織化學 將石蠟切片烤片，脫蠟，復水后，95℃抗原修復25 min。3%的過氧化氫孵育10 min后于4℃一抗孵育過夜。經(jīng)辣根過氧化物酶標記的二抗孵育后，DAB染色，結晶紫復染、返藍后與顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4含藥血清制取 將黨參12 g、菟絲子15 g、白術6 g、白芍12 g、杜仲12 g、桑寄生12 g、蘇梗 6 g、條黃芪15 g煎煮后過濾，真空抽干制成粉劑，用蒸餾水重懸后灌喂大鼠。將大鼠分為兩組，一組灌喂中藥復方，一組灌喂生理鹽水，灌喂劑量為 16 g/kg。每天灌喂1次，灌喂5 d后處死大鼠，腹主動脈采血，分離血清，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5共培養(yǎng)體系建立 HTR-8/SVneo按5×104每孔種于24孔板中，過夜貼壁后加入不同處理因素，包括1-MT,含10%對照血清的培養(yǎng)液，含10%中藥血清培養(yǎng)液，10%中藥血清培養(yǎng)液聯(lián)合1-MT等。處理48 h后，棄去培養(yǎng)液，更換新鮮培養(yǎng)液并按1∶1細胞比例加入外周NK細胞，共培養(yǎng)48 h。

1.2.6NK細胞表面分子的檢測 收取不同處理組的NK細胞，PBS洗滌，離心，棄上清。每管加入100 μl buffer重懸，根據(jù)細胞量加入相應量細胞流式抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌后上機檢測。

2 結果

2.1復發(fā)性流產(chǎn)患者與正常人工流產(chǎn)孕婦絨毛組織IDO的表達 對正常人工流產(chǎn)孕婦與復發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織石蠟切片進行免疫組織化學染色，結果顯示絨毛組織高表達IDO，且在胞核與胞漿中均有IDO的表達。與復發(fā)性流產(chǎn)患者相比，正常人工流產(chǎn)孕婦絨毛組織中的IDO表達明顯較高，差異具有顯著性(圖1)。這一結果表明復發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中的IDO表達較正常孕婦低。

2.2含藥血清對滋養(yǎng)細胞IDO表達的影響 HTR-8/SVneo經(jīng)對照血清培養(yǎng)液和含藥血清培養(yǎng)液處理48 h后，用流式細胞儀檢測IDO的表達。實驗結果顯示，含藥血清培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞表達較高水平的IDO。與對照組相比，中藥可以有效提高IDO陽性的滋養(yǎng)細胞比例(圖2)。

圖1 復發(fā)性流產(chǎn)患者與正常人工流產(chǎn)孕婦絨毛組織IDO的表達Fig.1 IDO expression in recurrent spontaneous abortion patients and normal pregnant womenNote: A,D.Incubated with PBS;B,E.Incubated with mouse anti-human IDO antibody;C,F.Magnified picture of typical positive position.

圖3 滋養(yǎng)細胞對外周NK細胞表型的影響及補腎益氣方的調節(jié)作用Fig.3 Influence of trophoblast in phenotype of peripheral NK cells and role of Kidney-replenishing herb in this processNote: HTR-8-,1-MT- means peripheral NK cells cultured alone,HTR-8+,1-MT- means peripheral NK cells cultured with HTR-8 without 1-MT,HTR-8+,1-MT+ means peripheral NK cells cultured with HTR-8,which has been treated with 1-MT for 48 hours.Ctrl.Control serum medium;Herb.Herb serum medium;H+1-MT.Herb medium supplemented with 1-MT.NS.P>0.05;*.P<0.01；**.P<0.001;***.P<0.000 1.

圖2 含藥血清對滋養(yǎng)細胞IDO表達的影響Fig.2 Effect of Kidney-replenishing herb on expression of IDO in trophoblastsNote: A.Control serum group,IDO expression;B.Herb serum treated group,IDO expression;C.Statistical results from A and B,**.P<0.001.

2.3滋養(yǎng)細胞對外周NK細胞表型轉化的誘導作用及補腎益氣方的調節(jié)機制 約90%外周NK細胞表達CD16,經(jīng)與HTR-8/SVneo共培養(yǎng)后，CD16的表達水平顯著下降。當滋養(yǎng)細胞內的IDO活性被1-MT阻斷后，NK細胞表達CD16的比例上升。提示滋養(yǎng)細胞具有誘導外周NK細胞向蛻膜NK細胞轉變的功能，且IDO在其中發(fā)揮了一定的作用。此外，外周NK細胞與滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)后，CD56的平均熒光密度增強，但1-MT對該過程無明顯影響，提示滋養(yǎng)細胞對外周NK細胞CD56的調節(jié)作用不依賴于IDO(圖3A、B)。

與對照血清組相比，中藥血清處理后的滋養(yǎng)細胞具有更強的抑制外周NK細胞表達CD16的功能，且這種抑制作用可以被1-MT逆轉，提示含藥血清可以通過影響滋養(yǎng)細胞IDO的表達調節(jié)外周NK細胞的表型轉化。同時，含藥血清組NK細胞表達的CD56較對照組高，1-MT也不能逆轉這一改變(圖3C、D)。這些結果表明滋養(yǎng)細胞以IDO依賴的機制誘導外周NK細胞CD16的降低，以IDO非依賴的方式誘導外周NK細胞CD56的升高，補腎益氣方可以對這一過程發(fā)揮調節(jié)作用。

3 討論

復發(fā)性流產(chǎn)是婦產(chǎn)科的常見疾病，因其發(fā)病機制復雜多樣，且有很大一部分目前尚不能找到明確原因，治療效果仍很有限。其中，中醫(yī)藥在復發(fā)性流產(chǎn)的治療中起到了一定的作用。在既往的研究中，學者們對補腎益氣方在復發(fā)性流產(chǎn)治療中的應用進行了探討。盧穎瑩等[5]利用溴隱亭誘導的流產(chǎn)大鼠模型進行實驗，驗證了補腎益氣方可以明顯減少黃體的退化性病理改變、降低大鼠的流產(chǎn)率、增加胚胎數(shù)。孫艷玲等[4]的研究結果表明補腎益氣方聯(lián)合黃體酮可以改善復發(fā)性流產(chǎn)患者的預后，提高足月分娩率。補腎益氣方治療復發(fā)性流產(chǎn)的機制還有待研究，以目前的研究結果看，一方面可能是由于補腎益氣方具有一定的免疫調節(jié)作用，可以改善機體整體及蛻膜局部的免疫狀態(tài)，另一方面可能是補腎益氣方對機體的內分泌平衡有一定的幫助，可以調節(jié)女性下丘腦-垂體-卵巢軸的功能。多項實驗表明，補腎益氣方對復發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜局部及外周血中Treg細胞、Th17細胞的平衡有調節(jié)作用，可以上調Treg的比例，增加抗炎性細胞因子IL-10、IL-4的表達，而降低TNF-α、IFN-γ、IL-17的表達，促進形成耐受型的免疫微環(huán)境[6-10]。

IDO在正常妊娠的過程中具有重要意義。蛻膜局部的IDO可以誘導Treg細胞的分化，抑制效應性T細胞的增殖和活化，并對多種免疫細胞包括巨噬細胞、B細胞、DC細胞等都具有一定的調節(jié)功能，有利于維持母胎界面的耐受狀態(tài)[9,10]。Zong等[11]的研究表明，IDO可以促進滋養(yǎng)細胞的增殖和侵襲，而不明原因流產(chǎn)患者絨毛組織中IDO表達降低可能是導致不良妊娠結局的原因。Obayashi等[9]認為絨毛組織中IDO的表達量和活性可能在不明原因流產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。而IDO對NK細胞的調節(jié)作用，可能是由于IDO催化色氨酸代謝為犬尿氨酸及下游代謝產(chǎn)物所引起的局部微環(huán)境改變造成的。色氨酸缺乏導致的空載tRNA增多，可以激活細胞內的GCN2激酶，特異性地磷酸化eIF2，降低胞內的蛋白合成水平，抑制免疫細胞的效應[12,13]。犬尿氨酸及下游代謝產(chǎn)物可以通過配體受體結合的方式，向胞內傳遞信號，調節(jié)免疫細胞的狀態(tài)[14,15]。

NK細胞是蛻膜局部比例最高的一種免疫細胞，在母胎免疫耐受中發(fā)揮了重要的作用。妊娠期間NK細胞在母胎界面大量聚集，主要依賴兩種方式：一種是外周NK細胞在蛻膜局部趨化因子的作用下向母胎界面移動，一種是蛻膜局部的造血干細胞在局部微環(huán)境的調控下分化而成。外周NK細胞的表型主要為CD56+CD16+,而蛻膜NK細胞主要表現(xiàn)為CD56brightCD16dim，并表達殺傷細胞抑制性受體KIR，在滋養(yǎng)細胞表達的非經(jīng)典的MHCⅠ類分子的啟動下，向胞內轉導抑制性信號，保護胚胎來源的細胞不被殺傷[16,17]。除此之外，蛻膜NK細胞還表現(xiàn)出與外周NK細胞不一樣的功能，它可以分泌多種細胞因子，如IL-4、IL-10等，調控滋養(yǎng)細胞的侵襲，促進胎盤血管形成[18]。蛻膜局部的NK細胞有很大一部分來自于外周，經(jīng)誘導教育之后其表型發(fā)生轉化而表現(xiàn)為耐受表型，但具體的機制目前仍有很多沒有明確。在本篇文章中，我們驗證了滋養(yǎng)細胞可以誘導外周NK細胞的表型向蛻膜表型的改變，并且CD16的轉變依賴于滋養(yǎng)細胞IDO，CD56的轉變不依賴于IDO。而補腎益氣方可以增加滋養(yǎng)細胞IDO的表達，并能通過上調滋養(yǎng)細胞IDO的水平來增強其調節(jié)能力。與之相類似的是，補腎益氣方可以通過上調滋養(yǎng)細胞IDO的表達抑制外周NK細胞CD16的表達，而補腎益氣方對CD56的調節(jié)作用則不依賴于滋養(yǎng)細胞IDO的表達。

本文從補腎益氣方具有免疫調節(jié)作用的角度出發(fā)，驗證了補腎益氣方通過上調滋養(yǎng)細胞IDO的表達，影響了滋養(yǎng)細胞對NK細胞的調節(jié)作用，促進了外周NK細胞進入蛻膜局部之后的表型轉化，有利于維持蛻膜局部的免疫耐受狀態(tài)，為補腎益氣方治療復發(fā)性流產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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