王 妍，景 嵐，李鑫淳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

銹病是世界范圍廣泛分布的農(nóng)作物及森林植物的重大災(zāi)害性病害[1-3]。向日葵銹菌(PucciniahelianthiSchw.)屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)柄銹菌屬(Puccinia)，它是5種孢子俱全的單主寄生菌。被侵染植株因光合作用受阻以及蒸騰作用加強(qiáng)而引起植株養(yǎng)分和水分供給不足，最終導(dǎo)致向日葵的空殼率增加，果實(shí)瘦小，向日葵的含油量和產(chǎn)量下降[4-5]。

目前，對(duì)于該病害的防治主要是種植抗病品種，但該病菌可以通過(guò)多次無(wú)性繁殖產(chǎn)生雙核夏孢子進(jìn)行傳播[6]，并且可以通過(guò)異核作用進(jìn)行基因重組產(chǎn)生新的致病性小種[7]，從而造成病害大流行。近幾年來(lái)，景嵐等[8-9]在向日葵抗銹機(jī)制及誘導(dǎo)抗性、形態(tài)學(xué)解剖、以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究等方面展開(kāi)了工作。隨著分子生物學(xué)的興起，已將工作重心轉(zhuǎn)移至對(duì)向日葵銹菌系譜、群體進(jìn)化及遺傳多樣性研究等方面，如SCAR標(biāo)記的應(yīng)用對(duì)及微衛(wèi)星的分析等[10-14]。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)主要是指基因組核苷酸水平上的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，同時(shí)也指同一物種不同個(gè)體間染色體上發(fā)生的單堿基的改變[15]。其單個(gè)堿基的改變形式主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)換(嘌呤突變?yōu)猷堰驶蜞奏ね蛔優(yōu)猷奏?、顛換(嘌呤突變?yōu)猷奏せ蜞奏ね蛔優(yōu)猷堰?以及插入、缺失等。一般情況下，轉(zhuǎn)換比顛換更易發(fā)生，轉(zhuǎn)換發(fā)生概率為2/3，顛換發(fā)生的概率為1/3。對(duì)于不同的堿基組成序列SNP發(fā)生頻率也不同，在GC序列上出現(xiàn)的頻率最高，且多發(fā)生在C和T之間[16]。SNP是一種常見(jiàn)的可遺傳變異，占所有已知多態(tài)性的90%以上，已被應(yīng)用于基因定位、克隆和鑒定。由美國(guó)學(xué)者 Lander[17]在 1996 年首次提出的SNP 標(biāo)記是第三代 DNA 遺傳標(biāo)記，相比前幾代RFLP和SSR標(biāo)記，SNP具有突變率低、可穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)，并且其具有雙等位基因多態(tài)性，使標(biāo)記更為有效[18-19]。目前，公共可用的 SNP 絕大部分來(lái)自大規(guī)?；蚪M測(cè)序工作，基于轉(zhuǎn)錄組及其他EST序列開(kāi)發(fā)的SNP標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于玉米、大豆、小麥、人類和寄生蟲等的遺傳圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性研究[20-24]。

銹菌為專性寄生菌，難以在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生活史復(fù)雜，具多型現(xiàn)象且遺傳轉(zhuǎn)化困難，使得銹菌的基因組學(xué)及基因功能研究相對(duì)緩慢。近年來(lái)，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)的迅猛發(fā)展，為最終揭示銹菌生活史復(fù)雜性和毒性高度變異性的根本成因提供了有力工具。

為進(jìn)一步探究向日葵銹菌的致病機(jī)制，本研究利用向日葵銹菌330小種轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)軟件對(duì)銹菌SNP進(jìn)行較大規(guī)模的開(kāi)發(fā)，同時(shí)對(duì)發(fā)現(xiàn)含有SNP位點(diǎn)的基因進(jìn)行功能注釋，認(rèn)識(shí)其基因功能的同時(shí)，進(jìn)一步找到可能與向日葵銹菌致病性相關(guān)基因連鎖的SNP標(biāo)記，從而為向日葵銹菌致病性、向日葵銹菌遺傳進(jìn)化研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及數(shù)據(jù)來(lái)源

由北京博奧公司利用Illumina HiSeqTM2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)0，4，8 h萌發(fā)的向日葵銹菌夏孢子(330小種)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Trinity 軟件進(jìn)行從頭組裝，共獲得386 417 962 個(gè)Clean reads，其測(cè)序堿基數(shù)量為39.03 Gb，拼接獲得向日葵銹菌Unigene 59 409個(gè)，總長(zhǎng)度為82 821 009 bp,其中編碼區(qū)長(zhǎng)37 781 360 bp，非編碼區(qū)長(zhǎng)45 039 649 bp，平均每個(gè)Unigene的長(zhǎng)度為1 394 bp。測(cè)序原始數(shù)據(jù)已上傳至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)，數(shù)據(jù)接收號(hào)為SRP 059 519。使用軟件SOAPsnp(http：//soap.genomics.org.cn/soapsnp.html)對(duì)得到的59 409條Unigene序列進(jìn)行SNP檢測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

通過(guò)BlastX(E-value<10-5)將含有SNP位點(diǎn)的序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)Nr(Non-redundant protein database)和InterProScan中，然后通過(guò)BlastN(E-value<10-5)將此Unigene比對(duì)到核酸數(shù)據(jù)庫(kù)Nt(Non-redundant nucleotide database)中，得到與給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。

根據(jù)Nr注釋信息，使用Blast2GO軟件得到SNP-unigene的GO(Gene Ontology)注釋信息后，用WEGO軟件對(duì)所有Unigene做GO功能分類統(tǒng)計(jì)。通過(guò)BlastX(E-value<10-10)將SNP-Unigene序列比對(duì)到COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)數(shù)據(jù)庫(kù)，從而獲得其COG分類注釋。通過(guò)BlastX(E-value<10-10)將SNP-Unigene序列比對(duì)到KEGG生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.genome.jp/kegg/)，根據(jù)KEGG注釋信息進(jìn)一步得到Unigene 的pathway注釋。最后利用BlastX(E-value<10-10)將SNP-Unigene序列比對(duì)到PHI-Base(Pathogen Host Interactions)數(shù)據(jù)庫(kù)，從而得到可能與向日葵銹菌致病性相關(guān)的蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 向日葵銹菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)SNP檢測(cè)

使用SOAPsnp對(duì)59 409條Unigene的序列信息進(jìn)行檢測(cè)后，共發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)29 964個(gè)，分布在8 321條Unigene上，其中有10 886個(gè)在編碼區(qū)。向日葵銹菌轉(zhuǎn)錄組SNP的發(fā)生頻率為1/2 764 bp，即平均每2 764 bp就有1個(gè)SNP位點(diǎn)出現(xiàn)，其中，SNP在編碼區(qū)的發(fā)生頻率為1/3 471 bp；在非編碼區(qū)的發(fā)生頻率為1/2 361 bp。在總的29 966個(gè)SNP中，轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率為65.40%，顛換發(fā)生的頻率為34.60%。在這6種單核苷酸變異中以A/G和C/T發(fā)生頻率最高，分別達(dá)到總數(shù)的32.80%和32.60%，其他4種A/T、A/C、G/T和G/C則分別占到SNP總數(shù)的11.22%，9.18%，8.40%和5.80%(表1)。

表1 向日葵銹菌SNP 轉(zhuǎn)換、顛換情況統(tǒng)計(jì)Tab.1 SNP transition and transversion statistic of P.helianthi

2.2 SNP-Unigene 的功能注釋

將所有8 321條SNP-Unigene序列與GenBank中的Nr 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性BlastX比對(duì)發(fā)現(xiàn)，79.46%的Unigene與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因同源被注釋；通過(guò)BlastN與GenBank中的Nt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，43.00%的Unigene能在Nt數(shù)據(jù)庫(kù)中找到與之匹配的注釋信息；與另一蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)InterProScan進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果有58.59% 的Unigene被注釋，其中包含磷酸酶，各種氧化酶、水解酶等。

2.2.1 SNP-Unigene的GO分類 根據(jù) Nr注釋信息，使用Blast2GO軟件和 WEGO軟件對(duì)8 321條SNP-Unigene進(jìn)行GO功能分類，結(jié)果表明，其中3 073條Unigene被分配到38個(gè)GO功能分類中，1 134條Unigene被分配到細(xì)胞組分的13個(gè)子類中，數(shù)目最多的類別是參與細(xì)胞和細(xì)胞部分，占總Unigene數(shù)目的比例都為35.70%；2 017條Unigene被分配到分子功能的11個(gè)子類中，數(shù)目最多的類別是結(jié)合和催化，分別為41.23%和34.57%；2 025條Unigene被分配到生物過(guò)程中的14個(gè)子類中，其中代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程所占比例最高，分別為49.04%和45.34%(圖1)。

圖1 向日葵銹菌SNP-Unigene GO分類Fig.1 GO classification of P.helianthi SNP-Unigene

2.2.2 SNP-Unigene的COG功能分類 COG是對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù)。將8 321條SNP-Unigene序列比對(duì)到COG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相關(guān)基因功能的預(yù)測(cè)和分類。結(jié)果顯示有2 539條Unigene能在COG中找到了相應(yīng)的注釋信息，根據(jù)其功能可以被分為24類。從分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，這2 539條被注釋的Unigene涉及大多數(shù)的生命活動(dòng)過(guò)程或功能。一般功能預(yù)測(cè)類是最大的一個(gè)分類，占被注釋Unigene的16.27%；其次是翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成與翻譯后修飾、蛋白翻轉(zhuǎn)和分子伴侶，分別占比14.45%，12.01%。核結(jié)構(gòu)和細(xì)胞遷移2個(gè)分類中包含SNP-Unigene最少，分別占比0.08%，0.12%(圖2)。

2.2.3 SNP-Unigene的KEGG代謝通路分析 對(duì)8 321條Unigene序列進(jìn)行KEGG代謝通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有2 689條Unigene序列獲得了注釋，分別參與到物質(zhì)代謝、遺傳信息過(guò)程、環(huán)境信息過(guò)程、細(xì)胞學(xué)過(guò)程、有機(jī)體系統(tǒng)、人類疾病六大類生化代謝途徑(表2)。分類結(jié)果顯示，涉及遺傳信息過(guò)程通路的Unigene最多，占總注釋量的42.99%，并以翻譯占比最多；其次為物質(zhì)代謝通路22.16%，并以氨基酸代謝和糖代謝占比最多；17.29%涉及細(xì)胞學(xué)過(guò)程通路，并以轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝占比最多；涉及有機(jī)體系統(tǒng)通路的Unigene最少，占1.30%。

A．RNA加工和修飾；B.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)；C.能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化；D.細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂和染色體分區(qū)；E.氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；F.核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；G.碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；H.輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；I.脂類轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；J.翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成；K.轉(zhuǎn)錄；L.復(fù)制、重組和修復(fù)；M.細(xì)胞壁/膜/胞膜生物合成；N.細(xì)胞遷移；O.翻譯后修飾、蛋白翻轉(zhuǎn)和分子伴侶；P.無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；Q.次生代謝物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；R.一般功能預(yù)測(cè)；S.功能未知；T.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；U.細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和膜泡運(yùn)輸；V.防御系統(tǒng)；Y.核結(jié)構(gòu)；Z.細(xì)胞骨架。

A．RNA processing and modification；B.Chromatin structure and dynamics；C.Energy production and conversion；D.Cell cycle control，cell division，chromosome partitioning；E.Amino acid transport and metabolism；F.Nucleotide transport and metabolism；G.Carbohydrate transport and metabolism；H.Coenzyme transport and metabolism；I.Lipid transport and metabolism；J.Translation，ribosomal structure and biogenesis；K.Transcription；L.Replication，recombination and repair；M.Cell wall/membrane/envelope biogenesis；N.Cell motility；O.Posttranslational modification，protein turnover，chaperones；P.Inorganic ion transport and metabolism；Q.Secondary metabolites biosynthesis，transport and catabolism；R.General function prediction only；S.Function unknown；T.Signal transduction mechanisms；U.Intracellular trafficking，secretion，and vesicular transport；V.Defense mechanisms；Y.Nuclear structure；Z.Cytoskeleton.

圖2 向日葵銹菌SNP-Unigene COG功能分類Fig.2 COG functional classifications of P. helianthi SNP-Unigene

表2(續(xù))

2.2.4 SNP-Unigene的PHI比對(duì) 利用BlastX將向日葵銹菌的SNP-Unigene與PHI-Base進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，有961條Unigene序列與已知的致病基因相匹配(表3)，其中，數(shù)目最多的為降低致病性基因，占總已知致病基因的44.54%，如熱休克蛋白、細(xì)胞色素、蛋白磷酸酶2C等；其次是不影響致病力的基因231條，如重復(fù)錨蛋白、鋅指、核糖體蛋白S17等；喪失致病力基因有118條，如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、肽酶C54、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域；混合結(jié)果80 條；最后是效應(yīng)因子有4條，將這4條含有效應(yīng)因子的基因比對(duì)到Nr庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)只有序列XRKXJ_Cluster 8 762被注釋，且與絲氨酸蛋白酶有關(guān)。

表3 向日葵銹菌SNP-Unigene PHI分類Tab.3 PHI classifications of P.helianthi SNP-Unigene

3 討論

基于銹菌基因組巨大、雜合度高[25]，向日葵銹菌的SNP開(kāi)發(fā)有其復(fù)雜性。與樹(shù)鼩[26]、蘋果[27]、梨[28]、玫瑰[29]、小麥[30]等其他動(dòng)植物相比，銹菌的遺傳背景研究也相對(duì)滯后，目前，尚未見(jiàn)有關(guān)向日葵銹菌轉(zhuǎn)錄組SNP的相關(guān)報(bào)道。而近年來(lái)基于試驗(yàn)數(shù)據(jù)所建立的生物信息學(xué)算法的發(fā)展以及向日葵銹菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得，為轉(zhuǎn)錄組水平的向日葵銹菌SNP的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了可能。

本研究對(duì)59 409 條向日葵銹菌的Unigene序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組SNP位點(diǎn)挖掘及其功能注釋分析，共鑒定出29 966個(gè)SNP，總覆蓋長(zhǎng)度為 82 821 009 bp，轉(zhuǎn)錄組SNP 的發(fā)生頻率為 1/2 764 bp，高于辣椒(1/6 200 bp)[31]，低于人類基因組(約1/1 000 bp)，樹(shù)鼩(1/164 bp)[26]、蘋果(1/288 bp)[27]、梨(1/344 bp)[28]、葡萄(1/64 bp)[32]、玫瑰(1/1 173 bp)[29]和小麥(1/540 bp)[30]等大多數(shù)動(dòng)植物。這種頻率差異主要與研究材料的遺傳背景差異有關(guān)，還可能是由檢測(cè)方法和檢測(cè)軟件參數(shù)不同造成的。SNP 頻率越高表明遺傳背景差異越大[33]。向日葵銹菌SNP在編碼區(qū)的發(fā)生頻率為1/3 471 bp，在非編碼區(qū)的發(fā)生頻率為1/2 361 bp，由此可見(jiàn)，在編碼區(qū)發(fā)生的頻率明顯低于非編碼區(qū)發(fā)生的頻率，這是在自然選擇壓力的作用下為保證功能區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中的保守性所形成的，符合Syv?nen[34]曾經(jīng)報(bào)道的大多數(shù)SNPs位于基因組非編碼區(qū)上，少數(shù)位于基因的編碼區(qū)上的論述。本研究中6種單核苷酸變異以A/G和C/T發(fā)生頻率最高，分別占總數(shù)的32.80%和32.60%，與大多數(shù)物種的變異頻率基本相似，不僅符合一般的轉(zhuǎn)換、顛換發(fā)生頻率(即轉(zhuǎn)換發(fā)生的概率為2/3，顛換發(fā)生的概率是轉(zhuǎn)換的一半為1/3[16])，而且相似于人類基因組的轉(zhuǎn)換、顛換發(fā)生頻率，而人類基因組中出現(xiàn)這種頻率是由于人類基因組中CpG 二核苷酸中的胞嘧啶最容易發(fā)生突變，其中大多數(shù)是由甲基化自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶[35]，因此轉(zhuǎn)換型變異的頻率較高，約占2/3，其他幾種類型的SNP發(fā)生頻率基本相同。將8 321條包含SNP位點(diǎn)的Unigene序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)Nr、InterProScan和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)Nt中，分別有79.46%，58.59%和43.00%的序列被注釋。有研究表明，較長(zhǎng)的序列越容易得到注釋信息，與公共數(shù)據(jù)越容易匹配[36-37]。本次向日葵銹菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序最后組裝得到的Unigene序列，其平均長(zhǎng)度達(dá)到1 394 bp，但卻不符合這一規(guī)律，其中大部分的序列未能被注釋，這可能是由于向日葵銹菌是一種專性寄生菌，有其特異性基因，因此與公共數(shù)據(jù)庫(kù)較難匹配。

COG注釋信息中，向日葵銹菌含有24種COG功能類型，主要包括細(xì)胞代謝和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，其中有2 539個(gè)Unigene基因可以匹配到相應(yīng)的COG功能注釋中，經(jīng)過(guò)對(duì)各功能類別基因數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中占比較多的類別主要有：一般功能預(yù)測(cè)；翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成；翻譯后修飾、蛋白翻轉(zhuǎn)和分子伴侶等。這些類別對(duì)病原菌的調(diào)節(jié)過(guò)程涉及廣泛，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老、死亡等都有修飾調(diào)節(jié)作用，且相互協(xié)調(diào)、相互影響[38]。這些功能也許與銹菌的生活及侵染有很大的關(guān)系，這也符合在KEGG分析中2 689條Unigene注釋序列中涉及遺傳信息過(guò)程通路的Unigene最多，主要以翻譯為主。說(shuō)明蛋白對(duì)于病原菌的侵染有十分重要的作用。

真菌遺傳圖譜的構(gòu)建工作較高等動(dòng)植物起步晚，其構(gòu)建方法主要參考高等動(dòng)植物。在真菌群中，開(kāi)發(fā)數(shù)量充足且多態(tài)性好的分子標(biāo)記用來(lái)構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜的應(yīng)用目前還有待深入研究。開(kāi)發(fā)與向日葵銹菌致病性相連鎖的SNP分子標(biāo)記，對(duì)向日葵抗病育種的研究具有重大意義。 目前，未見(jiàn)關(guān)于向日葵銹菌致病性相關(guān)SNP標(biāo)記的報(bào)道。本研究嘗試用生物信息學(xué)方法，從向日葵銹菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中大規(guī)模開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，并篩選可能與致病性相關(guān)的SNP標(biāo)記。Garnica等[39]研究認(rèn)為，銹菌的致病性是由真菌細(xì)胞壁修飾蛋白和潛在的致病效應(yīng)蛋白所致。病原菌與寄主互作初期通常會(huì)產(chǎn)生激發(fā)子引發(fā)寄主的防衛(wèi)反應(yīng)，而大多數(shù)激發(fā)子屬于多糖、多肽、糖蛋白等一類小分子化合物。利用Blast將向日葵銹菌Unigene與PHI-Base中的致病蛋白進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有961條Unigene與向日葵銹菌的致病性有關(guān)，其中有4個(gè)基因?yàn)橹参锓遣≡曰蚣葱?yīng)因子。將這4個(gè)效應(yīng)因子比對(duì)到Nr庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)序列XRKXJ_Cluster 8 762與絲氨酸蛋白酶有關(guān)，而絲氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白酶家族，其生物學(xué)功能豐富多樣，同時(shí)還是細(xì)菌和真菌病原對(duì)抗宿主的重要致病因素[40]，并大量產(chǎn)生于病原真菌[41]，符合此序列測(cè)序時(shí)測(cè)出的高表達(dá)量這一說(shuō)法。根據(jù)測(cè)序得到的序列信息進(jìn)行SNP引物設(shè)計(jì)，使用CAPS標(biāo)記法或其他檢測(cè)方法對(duì)開(kāi)發(fā)的SNP進(jìn)行檢測(cè)和對(duì)向日葵致病性相關(guān)SNP的進(jìn)一步鑒定等工作尚在進(jìn)行中。向日葵銹菌相關(guān)生物信息的不斷完善，將為開(kāi)發(fā)SNP遺傳多樣性引物、遺傳圖譜的構(gòu)建、目標(biāo)基因的標(biāo)定、指紋圖譜繪制等提供理論依據(jù)。

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