陳冠旭，秦貴龍，李恩廣，趙春梅，喬利仙，2，王晶珊，2，隋炯明，2

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東省旱作技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

PP2C(PP2C-type protein phosphatase)是一類單體絲氨酸/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶[1-2]，其活性依賴于Mg2+或Mn2+等二價(jià)陽離子，并且嚴(yán)格受其調(diào)節(jié)。進(jìn)化分析表明，PP2C蛋白在進(jìn)化過程中相對(duì)保守[3]，它廣泛存在于低等生物和高等生物中，而且在植物中PP2C基因的數(shù)量最多[4]。目前，在擬南芥、玉米、水稻等植物中都篩選出了大量PP2C基因[5]。Liu等[6]報(bào)道了一個(gè)擬南芥基因AtPP2CG1，該基因編碼的蛋白屬于PP2C家族的G亞族，能夠調(diào)控?cái)M南芥對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，且其調(diào)控依賴于ABA。Schweighofer等[7]報(bào)道了擬南芥中76個(gè)PP2C基因，并將它們分成10個(gè)組。Xue等[8]利用生物信息學(xué)手段從水稻和擬南芥基因組中分別分離出78，80個(gè)PP2C基因，并分別將它們分為11，13個(gè)組。擬南芥中，A亞族的9個(gè)成員中包含6個(gè)負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)的蛋白：ABI1、ABI2、AHG1、AHG3/AtPP2CA、HAB1和HAB2[9]。在胡楊中也證實(shí)了A亞族的PeHAB1基因是ABA信號(hào)途徑中的調(diào)控基因[10-11]。在苜蓿中發(fā)現(xiàn)了一種受逆境脅迫誘導(dǎo)的屬于B亞族的PP2C(MP2C)蛋白，是MAPK途徑中的負(fù)調(diào)控因子[12]。C亞族的PP2C基因與花的器官發(fā)育有關(guān)[13]；而關(guān)于PP2C基因其他亞族的研究并不多。

Bhalothia等[14]在擬南芥和煙草中研究發(fā)現(xiàn)，PP2C通過催化可逆磷酸化，反作用于特定的蛋白激酶，下游信號(hào)負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)通路，可以加速植物的發(fā)育以及增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的耐受性。但是到目前為止，油料作物中有關(guān)PP2C基因的研究很少，更未見它們?cè)诨ㄉ泄δ苎芯康膱?bào)道。

前期試驗(yàn)中，以花生的胚小葉作為外植體，使用平陽霉素作為誘變劑進(jìn)行離體誘變，然后用羥脯氨酸作為篩選壓對(duì)愈傷組織定向篩選，獲得了一批羥脯氨酸耐性苗及其后代[15]，其中1個(gè)突變體(S2)在0.7% NaCl溶液中發(fā)芽率超過50%，且具有較高的SOD和POD值，而對(duì)照花育20(S4)在相同濃度的NaCl溶液中發(fā)芽率只有6.7%。本研究以測(cè)序完成的轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜為基礎(chǔ)[16]，利用生物信息學(xué)研究手段，在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平上篩選PP2C家族成員，進(jìn)行了PP2C基因的染色體定位和分類；利用在鹽脅迫處理前后測(cè)序獲得的多個(gè)時(shí)間段的表達(dá)譜，鑒定鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的PP2C基因，并進(jìn)行分子進(jìn)化分析，尋找氨基酸的保守功能域和啟動(dòng)子區(qū)域的保守順式調(diào)控元件。本研究將為探討花生PP2C基因的耐鹽功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用平陽霉素(Pingyangmycin)作為化學(xué)誘變劑，對(duì)花生品種花育20(S4)進(jìn)行離體誘變，使用羥脯氨酸(Hydroxyproline，HYP) 作為篩選壓，在MSB5有機(jī)培養(yǎng)基中進(jìn)行定向篩選，從后代中鑒定出1個(gè)在0.7% NaCl處理下發(fā)芽率顯著高于誘變親本，且可穩(wěn)定遺傳的耐鹽突變體(S2)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 沙培法將耐鹽突變體S2和對(duì)照S4的種子培養(yǎng)至幼苗期(約21～28 d)，用250 mmol/L NaCl溶液處理幼苗，在分別處理0，6，12，24，48 h后取葉片，每個(gè)樣品包含2個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將樣品混合后，送交測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫，處理數(shù)據(jù)后在NCBI數(shù)據(jù)庫注冊(cè)(注冊(cè)號(hào)SRR3114511)。用PFAM、NR、KEGG、KOG、SwissProt、GO、NT等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋。

1.2.2 鹽脅迫處理前后表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 采用Solexa技術(shù)對(duì)鹽脅迫處理前后的20個(gè)樣品進(jìn)行數(shù)字化表達(dá)譜測(cè)序，構(gòu)建花生葉片鹽脅迫處理前后的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，并以上述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為參考，對(duì)整理后的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫Unigene序列進(jìn)行分析，并在NCBI數(shù)據(jù)庫注冊(cè)(注冊(cè)號(hào)SRR3210665和SRR3210666)。

1.2.3PP2C基因家族成員鑒定、基因結(jié)構(gòu)分析和染色體定位 根據(jù)上述7大數(shù)據(jù)庫所得到的基因功能注釋結(jié)果，搜索PP2C基因。將其與花生全基因組數(shù)據(jù)(http：//www.peanutbase.org)中的A組野生種基因組序列進(jìn)行比對(duì)，下載同源性最高的序列。將同源序列翻譯成蛋白后，利用DNAMAN分析花生PP2C各個(gè)成員的蛋白分子量和理論等電點(diǎn)等信息。根據(jù)基因在A組野生種基因組序列和轉(zhuǎn)錄組序列比對(duì)結(jié)果，使用在線工具(Gene Structure Display Server 2.0)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，得到其外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。根據(jù)與花生全基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)后基因位置的結(jié)果，進(jìn)行染色體定位，得到各個(gè)基因在染色體上的分布結(jié)果。

1.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和同源比對(duì)分析 通過Clustal X軟件對(duì)擬南芥和花生PP2C蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，然后用軟件MEGA 6.0 生成PP2C基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 鹽脅迫響應(yīng)分析 利用鹽脅迫處理前后S2和S4的20個(gè)數(shù)字表達(dá)文庫譜，分析PP2C基因在脅迫處理前后的任何2個(gè)時(shí)間段的表達(dá)量，如果調(diào)整后的P值< 0.05，則認(rèn)為該基因?qū)}脅迫有響應(yīng)。

1.2.6PP2C基因啟動(dòng)子順式調(diào)控元件分析 選取受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的PP2C基因，利用Plantcare軟件分析其啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及PP2C家族基因的篩選

根據(jù)上述7大數(shù)據(jù)庫的基因功能預(yù)測(cè)，搜索PP2C基因，最終篩選出79個(gè)具有完整開放閱讀框的PP2C基因(圖1)。

圖1 79個(gè)PP2C基因在花生A基因組染色體上的位置Fig.1 The location of the 79 PP2C genes on the chromosomes of A genome from peanut

這79個(gè)PP2C基因共分布于花生A組野生種10條染色體上。其中，數(shù)量最多的，有15個(gè)成員分布在第9號(hào)染色體；其次為第1號(hào)和8號(hào)染色體，分別有11，12個(gè)PP2C基因，而第2號(hào)染色體上只有1個(gè)PP2C基因(圖1)?；ㄉ鶳P2C蛋白大小在不同成員間差別很大，為78～1 398個(gè)殘基，其等電點(diǎn)為4.14～10.21?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，外顯子個(gè)數(shù)2～23個(gè) (圖2)。

2.2 花生PP2C基因的聚類和同源比對(duì)分析

擬南芥中的PP2C基因可分為A～L 13個(gè)亞族，16個(gè)亞類。將篩選到的79個(gè)花生PP2C基因，與擬南芥的PP2C基因進(jìn)行了多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明，花生的絕大多數(shù)PP2C基因聚到除B亞族外的12個(gè)亞族，可分為15個(gè)亞類(圖3)。

2.3 鹽脅迫處理前后花生葉片表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及PP2C基因的鹽脅迫響應(yīng)分析

利用鹽脅迫處理前后S2和S4材料的20個(gè)數(shù)字表達(dá)文庫譜，對(duì)79個(gè)PP2C基因在鹽脅迫處理前后的任何2個(gè)時(shí)間段的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，根據(jù)調(diào)整后的P值，共篩選出35個(gè)PP2C基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)(圖4、表1)，涉及12個(gè)亞族14個(gè)亞類，其中A亞族b亞類、G亞族b亞類、I亞族、L亞族所有成員均受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，而G亞族a亞類的所有成員均不受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，35個(gè)PP2C基因中，7個(gè)基因(c38994_g1、c32376_g1、c9698_g1、c43142_g1、c34581_g2、c34200_g1和c24765_g1)只在S2中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；7個(gè)基因(c25744_g1、c42931_g1、c38232_g1、c34126_g1、c32418_g1、c32619_g2和c37903_g2)只在S4中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其余21個(gè)基因在S2和S4中均受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

在S2中，與脅迫處理前相比，6 h出現(xiàn)差異表達(dá)的基因數(shù)目最多，有23個(gè)，其中8個(gè)上調(diào)，15個(gè)下調(diào)；在48 h只有1個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)。而在S4中，與脅迫處理前相比，12 h出現(xiàn)差異表達(dá)的基因數(shù)目最多，共有18個(gè)差異基因，其中11個(gè)下調(diào)，7個(gè)上調(diào)；24 h出現(xiàn)差異表達(dá)的基因數(shù)目最少，只有3個(gè)(圖5)。

圖2 79個(gè)花生PP2C基因的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 The structure diagram of 79 PP2C genes in peanut

圖3 花生與擬南芥PP2C基因的聚類分析Fig.3 The clustering analysis of PP2C genes in peanut and Arabidopsis

圖4 鹽脅迫處理前后35個(gè)PP2C基因的表達(dá)情況Fig.4 Expression of 35 PP2C genes before and after salt stress treatment

亞族Subgroups亞類Subclasses受鹽脅迫誘導(dǎo)基因數(shù)The number of genes responsive to salinity stress基因代號(hào)Gene ID受鹽脅迫誘導(dǎo)基因數(shù)/總基因數(shù)The number of genes responsive to salinity stress/The number ofPP2C genesAa2c38232_g1、c42931_g12/4b2c36899_g1、c40455_g22/2B00/0C2c39126_g2、c41528_g12/10D5c34581_g2、c34581_g1、c38994_g1、c39003_g1、c25744_g15/11Ea3c30618_g1、c45163_g1、c25828_g13/7b3c35944_g1、c32418_g1、c32619_g23/4F12c43117_g1、c24765_g12/4F21c37903_g21/2Ga00/2b3c34126_g1、c43142_g1、c36599_g13/3H3c35011_g1、c33691_g1、c56870_g13/6I3c24443_g1、c37777_g2、c24598_g13/3J1c44239_g11/2K3c39153_g2、c9698_g1、c41013_g13/7L2c41121_g1、c43819_g12/2

S2.耐鹽突變體；S4.HY20 CK；例如：S2_6vsS2_0表示S2中處理6 h后與處理0 h表達(dá)量顯著差異的基因的數(shù)目，黑色代表上調(diào)，數(shù)目為8個(gè)；白色代表下調(diào)，數(shù)目為15個(gè)；依次類推。S2.Salt tolerant mutant；S4.HY20 CK；For example：S2_6vsS2_0 indicates the number of genes that are significantly different in expression of treatment 6 hours and 0 hours in S2，with black representing up-regulation，the number of which is 8，white representing down-regulation，the number of which is 15；and so on.

2.4 PP2C基因啟動(dòng)子順式調(diào)控元件分析

選取這35個(gè)受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的PP2C基因，利用Plantcare等軟件分析其啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件。研究發(fā)現(xiàn)分別有91%，80%，83%和80%的PP2C基因啟動(dòng)子含有HSE、MBS、TC-rich repeats和ARE這些脅迫響應(yīng)元件(圖6)。

圖6 35個(gè)花生PP2C基因啟動(dòng)子順式調(diào)控元件分析Fig.6 Analysis of cis-regulatory elements of the promoters of 35 PP2C genes in peanut

3 結(jié)論與討論

PP2C是一類具有多種功能的蛋白磷酸酶。目前，已經(jīng)有許多文章在不同的模式生物中對(duì)PP2C的多個(gè)成員進(jìn)行了特性分析以及鑒定。例如，MP2C是一個(gè)從苜蓿cDNA文庫中篩選到的參與MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)通路的PP2C類基因，直接作用于MAPK信號(hào)途徑中通過酵母雙雜交鑒定出的SIMK(Stress induced MAPK)，MP2C通過對(duì)SIMK中pTEpY序列的蘇氨酸殘基去磷酸化使SIMK信號(hào)途徑失活[17-18]。研究表明，植物受到創(chuàng)傷后葉片中的MP2C大量表達(dá)，而SIMK途徑隨著MP2C的表達(dá)而逐漸失活，說明MP2C是SIMK途徑的負(fù)調(diào)控因子[19-20]。玉米ZmPP2C基因在鹽和干旱脅迫反應(yīng)中作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子[21]。另有一些相關(guān)試驗(yàn)驗(yàn)證了PP2Cs基因在其他模式植物中的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起著負(fù)調(diào)控的作用，表明PP2Cs在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有相對(duì)保守的功能[22]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，小麥TaPP2C59基因的表達(dá)顯著受ABA、低溫和高鹽脅迫抑制。因此，可以推測(cè)TaPP2C59可能作為負(fù)調(diào)控因子參與ABA信號(hào)及非生物逆境脅迫應(yīng)答[23]。脅迫處理剛毛檉柳后，ThPP2C基因在剛毛檉柳根和葉中的表達(dá)均發(fā)生了明顯改變，但時(shí)空表達(dá)模式不完全相同。表明ThPP2C基因可能參與了剛毛檉柳高鹽、干旱以及激素處理的適應(yīng)過程，但其功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證[24]。

為了分析花生中PP2C基因家族的情況，利用構(gòu)建的花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)手段，在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平上篩選蛋白磷酸酶2C家族成員，鑒定出了79個(gè)具有完整開放閱讀框PP2C基因，位于花生A組野生種的10條染色體上。將篩選到的79個(gè)花生PP2C基因，與擬南芥的PP2C基因進(jìn)行了多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)花生的PP2C基因聚到除B外的12個(gè)亞族15個(gè)亞類中，還有一些沒有聚到任何亞族中，它們可能屬于一些新的亞族。利用鹽脅迫處理前后S2和S4的20個(gè)數(shù)字表達(dá)文庫譜，篩選到35個(gè)PP2C基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)絕大多PP2C基因啟動(dòng)子含有HSE、MBS、TC-rich repeats和ARE這些脅迫響應(yīng)元件。該研究為后續(xù)通過反向遺傳手段研究花生中PP2C的功能以及利用提供了理論基礎(chǔ)。

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