燕樹鋒，許蒙蒙，祝水金，郭新海，鐵雙貴

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002；2.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，浙江 杭州 310085)

草甘膦(Glyphosate)又名農(nóng)達(dá)、草甘寧、鎮(zhèn)草寧和膦甘酸等，是一種非選擇、內(nèi)吸傳導(dǎo)、廣譜、滅生性有機(jī)磷類除草劑，每年使用量約為8 500萬kg，是全球應(yīng)用最廣泛的除草劑[1-2]。草甘膦作用機(jī)制是在莽草酸途徑中與結(jié)構(gòu)類似物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)競(jìng)爭(zhēng)5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)活性位點(diǎn)，當(dāng)除草劑草甘膦與EPSPS酶結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合體EPSPS-S3P-草甘膦，造成莽草酸大量積累，阻斷了芳香族氨基酸及其次生產(chǎn)物的合成，進(jìn)而導(dǎo)致植株死亡[3-4]。

在轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花方面，Mon1445包含1個(gè)cp4-epsps基因，是第一個(gè)獲得商業(yè)化應(yīng)用的抗草甘膦棉花品種；Mon88913包含不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的2個(gè)cp4-epsps基因；拜耳公司的GHB614包含1個(gè)來源于玉米雙突變的2mepsps基因；在全球獲批商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花品種中，大多為上述3個(gè)轉(zhuǎn)化事件及其組配的雜交組合[5-6]。

我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉應(yīng)用率達(dá)93%，國產(chǎn)化比例超過95%，而國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花尚在研發(fā)過程中[7]。因此，本研究將浙江大學(xué)克隆并成功轉(zhuǎn)化陸地棉品種中棉所49獲得的8個(gè)轉(zhuǎn)epsps-G6基因抗草甘膦棉花株系為材料，對(duì)具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花進(jìn)行分子鑒定和遺傳分析，旨在為抗草甘膦棉花新種質(zhì)的育種應(yīng)用和商業(yè)化生產(chǎn)等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

G6-1、G6-4、G6-5、G6-7、G6-11、G6-19、G6-20、G6-25，是浙江大學(xué)通過花粉管通道法將其克隆的epsps-G6基因?qū)腙懙孛奁贩N中棉所49所獲得的8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)PCR檢測(cè)和草甘膦抗性鑒定證實(shí)目的基因已導(dǎo)入棉花基因組且草甘膦抗性得到表達(dá)；非轉(zhuǎn)基因的遺傳背景親本中棉所49，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供；陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1，由浙江大學(xué)祝水金教授課題組自交保存。

PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；TaqDNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶購于寶生物工程(大連)有限公司；Southern雜交試劑盒DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，由羅氏(Roche)公司生產(chǎn)；普通生化試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2 轉(zhuǎn)基因棉株的DNA提取

采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花及其背景親本中棉所49(對(duì)照)基因組DNA，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳之后，條帶整齊一致，無降解現(xiàn)象，紫外分光光度計(jì)測(cè)定的DNA濃度為500～1 000 ng/μL，OD260/280為1.8～1.9，能夠滿足PCR和分子雜交的需要。

1.3 Southern雜交檢測(cè)

epsps-G6基因探針標(biāo)記過程中所用引物序列為F：5′-ACAAGCTGAAGGGCCTGACCTA-3′和R：5′-CTCTGGTTCTCCAGGGTGATGTC-3′，目標(biāo)片段長(zhǎng)度為388 bp，用DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I試劑盒進(jìn)行探針標(biāo)記；Southern點(diǎn)雜交所需棉花基因組DNA含量為2 μg左右，直接點(diǎn)樣于尼龍膜上并自然晾干后，進(jìn)行DNA變性、中和(5×SSC中10～20 s)和DNA固定(120 ℃烘箱中30 min)等，其他預(yù)雜交、雜交、洗滌及免疫過程與Southern雜交相同；Southern雜交所需棉花基因組DNA含量為20～30 μg，雙酶切時(shí)選用的限制性內(nèi)切酶為Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ，單酶切時(shí)選用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，酶切后使用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳8～10 h，并使用毛細(xì)管印跡法進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)膜；探針標(biāo)記、探針靈敏度確定、預(yù)雜交、雜交及檢測(cè)等操作過程均嚴(yán)格按照羅氏Southern雜交試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.4 抗草甘膦性的遺傳分析

選用經(jīng)Southern雜交鑒定為單拷貝插入、自交純合且草甘膦抗性強(qiáng)的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系G6-1、G6-5、G6-19，分別與轉(zhuǎn)基因遺傳背景材料(中棉所49)和陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系(TM-1)進(jìn)行正反交，配制F1雜交組合，將F1雜交組合種植并自交后獲得F2雜交組合。F1和F2雜交組合草甘膦抗性鑒定均為待植株長(zhǎng)至2～4片真葉時(shí)，噴施20 mmol/L濃度的草甘膦溶液，噴藥7 d后調(diào)查各群體內(nèi)的抗性分離情況，并統(tǒng)計(jì)草甘膦抗性植株和不抗植株的比例，計(jì)算實(shí)測(cè)值與期望值的比率，并用χ2進(jìn)行測(cè)驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行χ2和P值計(jì)算，計(jì)算P值所用統(tǒng)計(jì)函數(shù)為CHIDIST。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因株系的Southern點(diǎn)雜交分析

分別取2 μg轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩忻匏?9的基因組DNA，直接點(diǎn)樣于尼龍膜上，用地高辛標(biāo)記后的epsps-G6基因片段做探針進(jìn)行Southern點(diǎn)雜交。由Southern點(diǎn)雜交結(jié)果(圖1)可知，非轉(zhuǎn)基因的中棉所49沒有檢測(cè)到雜交信號(hào)，轉(zhuǎn)基因株系G6-5、G6-19、G6-20、G6-25均檢測(cè)到較強(qiáng)的黑色點(diǎn)信號(hào)，這表明epsps-G6目的基因已經(jīng)成功導(dǎo)入棉花基因組。

CK.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?中棉所49)；1～4.轉(zhuǎn)化株系編號(hào)(G6-25、G6-19、G6-5、G6-20)。CK.Non-transgenic control(CCRI-49)；1-4.Putative transgenic lines(G6-25，G6-19，G6-5，G6-20).

2.2 轉(zhuǎn)基因株系的雙酶切Southern雜交分析

用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ對(duì)PCR檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)基因棉花株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩忻匏?9的基因組DNA進(jìn)行雙酶切，電泳分離后轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍膜上，用地高辛標(biāo)記后的epsps-G6基因片段做探針進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)。由雙酶切Southern雜交結(jié)果(圖2)可知，非轉(zhuǎn)基因中棉所49沒有檢測(cè)到雜交信號(hào)，轉(zhuǎn)基因株系G6-1、G6-25、G6-5、G6-19、G6-4、G6-11、G6-20均檢測(cè)到長(zhǎng)度一致的雜交條帶，這進(jìn)一步說明epsps-G6目的基因已經(jīng)成功導(dǎo)入到棉花基因組。

CK.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?中棉所49)；1～7.轉(zhuǎn)化株系編號(hào)(G6-1、G6-25、G6-5、G6-19、G6-4、G6-11、G6-20)。CK. Non-transgenic control(CCRI-49)；1-7. Putative transgenic lines(G6-1，G6-25，G6-5，G6-19，G6-4，G6-11，G6-20).

2.3 轉(zhuǎn)基因株系的單酶切Southern雜交分析

用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ對(duì)PCR檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花株系基因組DNA進(jìn)行單酶切，電泳分離后轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍膜上，用地高辛標(biāo)記后的epsps-G6基因片段做探針進(jìn)行單酶切的Southern雜交檢測(cè)(圖3)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系G6-25、G6-19、G6-20、G6-1、G6-7、G6-4、G6-5、G6-11均檢測(cè)到1～2條雜交條帶，其中G6-25、G6-20、G6-7、G6-4含有2個(gè)拷貝的epsps-G6基因，G6-19、G6-1、G6-5、G6-11含有單拷貝的epsps-G6基因，8個(gè)樣品中未檢測(cè)到多拷貝的epsps-G6基因，這也進(jìn)一步證實(shí)epsps-G6目的基因已經(jīng)成功導(dǎo)入棉花基因組。

1～8.轉(zhuǎn)化株系編號(hào)(G6-25、G6-19、G6-20、G6-1、G6-7、G6-4、G6-5、G6-11)。1-8. Putative transgenic lines(G6-25，G6-19，G6-20，G6-1，G6-7，G6-4，G6-5，G6-11).

2.4 抗草甘膦性狀的遺傳分析

選用含有單拷貝epsps-G6基因、自交純合且草甘膦抗性強(qiáng)的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系G6-1、G6-5和G6-19，分別與轉(zhuǎn)基因遺傳背景材料(中棉所49)和陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系(TM-1)進(jìn)行正反交，配制F1和F2雜交組合。2～4片真葉長(zhǎng)出時(shí)噴施20 mmol/L濃度草甘膦進(jìn)行抗性鑒定，噴藥7 d后調(diào)查抗性植株和不抗植株的數(shù)量，并進(jìn)行χ2測(cè)驗(yàn)，分析結(jié)果見表1。由轉(zhuǎn)基因株系G6-1、G6-5、G6-19與TM-1和中棉所49正反交F1雜交組合的草甘膦抗性鑒定結(jié)果可知，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系正反交雜種F1均表現(xiàn)為抗草甘膦，這表明抗草甘膦的epsps-G6基因均導(dǎo)入棉花核基因組，不受細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)的影響；由正反交F2雜交組合的草甘膦抗性鑒定結(jié)果可知，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的草甘膦抗性基因經(jīng)χ2檢驗(yàn)均符合3∶1的分離規(guī)律，這表明G6-1、G6-5、G6-19均插入了單拷貝的epsps-G6基因，該遺傳分析結(jié)果與單酶切Southern雜交檢測(cè)結(jié)果相互印證。

表1 轉(zhuǎn)基因棉花抗草甘膦性狀的遺傳分析Tab.1 Genetic analysis of glyphosate-resistant trait in transgenic cotton

表1(續(xù))

3 結(jié)論與討論

目前，得到商業(yè)化應(yīng)用的抗草甘膦基因主要包括對(duì)草甘膦不敏感的epsps基因，如cp4-epsps、2mepsps、mepsps等或在草甘膦發(fā)生作用前降解草甘膦的基因，如gat4601、gat4621和goxv247等，其中單獨(dú)的goxv247基因?qū)Σ莞熟⒌目剐运讲蛔?，商業(yè)化時(shí)常與對(duì)草甘膦不敏感的epsps基因合用[8-9]?？共莞熟psps-G6基因是浙江大學(xué)克隆自假單胞桿菌，并通過花粉管通道和莖尖農(nóng)桿菌介導(dǎo)等方法將該基因成功導(dǎo)入陸地棉品種中，這為自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花新品種選育等提供種質(zhì)基礎(chǔ)[10-11]。

在轉(zhuǎn)基因植物分子鑒定方面，Southen雜交技術(shù)假陽性率較低，可更好的證實(shí)外源基因整合入植物基因組；與定量PCR技術(shù)相比，可更直觀的鑒定外源基因在植物基因組上的拷貝數(shù)，因此成為轉(zhuǎn)基因研究中不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)之一。地高辛標(biāo)記與放射性標(biāo)記相比，不受試驗(yàn)條件限制，安全風(fēng)險(xiǎn)較低，通過對(duì)地高辛標(biāo)記Southern雜交條件的優(yōu)化和摸索，可取得與放射性標(biāo)記相同的試驗(yàn)效果，現(xiàn)已基本取代放射性標(biāo)記，被廣泛用于轉(zhuǎn)基因植物的分子鑒定程序[12-15]。Southern點(diǎn)雜交由于只需少量DNA(2 μg左右)，1 d內(nèi)即可完成，可用于Southern雜交的條件摸索和轉(zhuǎn)基因植株的初步鑒定；雙酶切的Southern雜交雖能更好表明外源基因整合入植物基因組，但不能鑒定轉(zhuǎn)基因株系的拷貝數(shù)；單酶切的Southern雜交不僅可明確目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，還可與遺傳分析相互印證，來鑒定轉(zhuǎn)基因株系的遺傳穩(wěn)定性。本研究通過Southern點(diǎn)雜交、雙酶切和單酶切的Southern雜交均證實(shí)目標(biāo)基因已經(jīng)整合入棉花基因組，且G6-25、G6-20、G6-7、G6-4含有2個(gè)拷貝的epsps-G6基因，G6-19、G6-1、G6-5、G6-11含有單拷貝的epsps-G6基因，這為轉(zhuǎn)epsps-G6基因抗草甘膦棉花的育種應(yīng)用等提供必要的分子基礎(chǔ)。

王秀紅等[16]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗草甘膦的epsps基因?qū)胗衩?，發(fā)現(xiàn)部分T1轉(zhuǎn)基因株系不符合孟德爾遺傳規(guī)律。此外，多項(xiàng)研究表明花粉管通道法、基因槍法、超聲波介導(dǎo)法等外源基因直接導(dǎo)入的方法易造成轉(zhuǎn)基因株系早代(T1和T2)分離不符合孟德爾遺傳的現(xiàn)象，但3代(T3)后趨于正常，并可穩(wěn)定遺傳[17-19]。本研究所使用材料早代有符合也有不符合孟德爾遺傳規(guī)律的現(xiàn)象，但自交純合后使用經(jīng)Southern雜交鑒定為單拷貝插入的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系G6-1、G6-5、G6-19與其背景親本中棉所49和陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1進(jìn)行正反交的遺傳分析，結(jié)果表明，這3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與中棉所49和TM-1正反交均符合3∶1的孟德爾分離規(guī)律，這再次證實(shí)上述3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均為單位點(diǎn)插入，抗性基因得到穩(wěn)定遺傳，這與上述研究結(jié)果一致[20]。

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