徐 宸，王 鑫，鐘 江

(1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；2.默克化工技術(shù)(上海)有限公司，上海 201203)

創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)是一種革蘭氏陰性桿菌，是廣泛存在于海洋和鹽湖中的嗜鹽病原菌。它是一種重要的水產(chǎn)品污染病原，可造成養(yǎng)殖水產(chǎn)品的病害。同時(shí)也是一種致命的人類機(jī)會(huì)致病菌，與全世界大部分食用污染海鮮致死的案例有關(guān)[1]。創(chuàng)傷弧菌感染最致命的后果是原發(fā)性敗血癥，其死亡率在免疫功能低下的人群中可達(dá)50%以上[2]。由于創(chuàng)傷弧菌感染的高死亡率，創(chuàng)傷弧菌污染嚴(yán)重地區(qū)海鮮食品(尤其是生蠔)的安全問題是常見的。創(chuàng)傷弧菌的感染不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失，而且也對(duì)人類健康造成危害。我國(guó)水產(chǎn)品品種豐富多樣，每年因食用水產(chǎn)品而引起食物中毒、急性胃腸炎或腹瀉等疾病屢有報(bào)道。因此，建立創(chuàng)傷弧菌的快速檢測(cè)方法顯得尤為非常重要。

傳統(tǒng)的創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)方法基于生理生化鑒定，由于弧菌屬主要病原表型相似性較高，給鑒別工作帶來較大困難，且鑒定過程費(fèi)力耗時(shí)，不利于病原的確定和采取應(yīng)對(duì)措施。 PCR和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)技術(shù)被用來檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌[3-4]。然而，使用PCR和定量PCR需要昂貴的熱循環(huán)儀，阻礙了這種方法的廣泛應(yīng)用。靈敏度更高的環(huán)介導(dǎo)等溫PCR技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)也被用于檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌，但該方法在現(xiàn)場(chǎng)操作過程中受環(huán)境影響較大，容易造成假陽(yáng)性[5]。幾種免疫分析方法，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫層析試紙條也被應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌的鑒定，檢測(cè)試紙的靈敏度可達(dá)2×106CFU/mL。Li等[6]報(bào)道了采用改良斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)哈維氏弧菌，靈敏度可達(dá)2×105CFU/mL，且整個(gè)操作時(shí)間由8 h縮短至2 h。筆者探索了將此改良方法用于創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)，以期為創(chuàng)傷弧菌快速準(zhǔn)確檢測(cè)方法的建立提供參考。

1.2材料

1.2.1菌株及試驗(yàn)動(dòng)物。創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 27562、溶藻弧菌(V.alginolyticus)標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17749購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)，陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)CMCC43501購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心。創(chuàng)傷弧菌FD-1、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院A301-8實(shí)驗(yàn)室保存。Sp2/0-Ag14(Sp2/0)小鼠骨髓瘤細(xì)胞株由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院A301-8實(shí)驗(yàn)室凍存。6～8周齡的雌性BALB/c小鼠購(gòu)于上海杰思捷公司。

1.2.2試劑及儀器。化學(xué)發(fā)光試劑ECL和TMB底物購(gòu)自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司。硝酸纖維素膜(NC膜)和聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)購(gòu)自美國(guó)Millipore。羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP和BSA購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。封閉劑PBSTB為2%(W/V)BSA溶解在PBST溶液中；封閉劑PBSTM為5%脫脂奶粉充分溶解在PBST溶液中，以上2種溶液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3方法

1.3.1抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體的制備。將創(chuàng)傷弧菌FD-1用TCBS培養(yǎng)基活化，標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27562為對(duì)照，培養(yǎng)后2株均呈現(xiàn)黃色特征性菌落。通過16 s rDNA 測(cè)序后Blast比對(duì)FQ-1與創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27562的同源度達(dá)99%。將創(chuàng)傷弧菌FQ-1擴(kuò)大培養(yǎng)，保存?zhèn)溆?。測(cè)得菌液濃度約為1×1010CFU/mL，細(xì)菌用0.3%的甲醛滅活24 h，滅活后菌液經(jīng)細(xì)菌檢驗(yàn)平板不再長(zhǎng)菌。滅活后的菌液于4 ℃保存?zhèn)溆?。以滅活?chuàng)傷弧菌菌體制備單克隆抗體，參照李強(qiáng)等[7]方法免疫BALB/c小鼠。篩選融合細(xì)胞采用新鮮培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌FQ-1。經(jīng)亞克隆化篩選后獲得可穩(wěn)定產(chǎn)生抗創(chuàng)傷弧菌抗體的雜交瘤細(xì)胞，將雜交瘤細(xì)胞密度調(diào)至2×106個(gè)/mL，以每只0.5 mL的量注入8周齡BALB /c小鼠腹腔內(nèi)，形成腹水后，以間接 ELISA 法檢測(cè)腹水效價(jià)。采用Protein A親和層析法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行純化，以紫外光分光光度計(jì)測(cè)量純化抗體濃度，將單抗溶液稀釋50倍，分別于260 nm和280 nm 波長(zhǎng)測(cè)吸光度，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2改良斑點(diǎn)雜交法。

1.3.2.1斑點(diǎn)雜交條件優(yōu)化。根據(jù)文獻(xiàn)[5]首先對(duì)封閉試劑、雜交膜以及封閉時(shí)間3個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化。將NC和 PVDF膜剪成邊長(zhǎng)為1 cm的正方形。將不同封閉劑PBSTB和PBSTM分別以每孔1 mL加入浸沒膜塊，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10、20、40 min，依次取出并以PBST將膜徹底沖洗干凈。將封閉后的膜塊放入稀釋度為1∶3 000的羊抗鼠二抗溶液中孵育90 min后取出并用PBST沖洗3次，最后用150 mL TMB顯色液將膜浸潤(rùn)并孵育10 min。

1.3.2.2改良斑點(diǎn)雜交法特異性檢測(cè)。分別將創(chuàng)傷弧菌FD-1、創(chuàng)傷弧菌(ATCC27562)、溶藻弧菌(ATCC17749)、哈維氏弧菌、副溶血弧菌置于TAB培養(yǎng)基(2.5%NaCl)于30 ℃過夜培養(yǎng)，將菌懸液稀釋成1×108CFU/mL，以空白TAB培養(yǎng)基(2.5%NaCl)為對(duì)照；取5 mL 5種菌懸液加入膜中間并在60 ℃烘烤20 min使其固定在膜上；將膜取出放入含5%脫脂奶粉的封閉劑中，37 ℃封閉25 min；接著將封閉后的膜放入抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體的稀釋液中，于37 ℃孵育60 min；用PBST將膜徹底沖洗干凈后放入稀釋度為1∶3 000的羊抗鼠二抗稀釋液中，同樣在37 ℃孵育90 min；最后將膜取出徹底洗盡殘留二抗并用濾紙吸干殘留的水分，將膜置于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中，同時(shí)加入ECL顯色液將膜浸潤(rùn)并在不同曝光時(shí)間下進(jìn)行拍照。

1.3.2.3改良斑點(diǎn)雜交法靈敏度檢測(cè)。將創(chuàng)傷弧菌懸液稀釋成1×108、1×107、1×106和1×105CFU/mL共4種濃度，并以稀釋液PBS作為空白對(duì)照。隨后，分別取5 mL不同濃度的菌懸液點(diǎn)于膜中央并置于60 ℃烘烤20 min將其固定在膜上；將膜取出放入含5%脫脂奶粉的封閉劑中，37 ℃封閉25 min；接著將封閉后的膜放入抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體的稀釋液中，于37 ℃孵育60 min；用PBST將膜徹底沖洗干凈后放入稀釋度為1∶3 000的羊抗鼠二抗稀釋液中，同樣在37 ℃孵育90 min；最后將膜取出徹底洗盡殘留二抗并用濾紙吸干殘留的水分，將膜置于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中，同時(shí)加入ECL顯色液將膜浸潤(rùn)并在不同曝光時(shí)間下進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體的制備以甲醛滅活的創(chuàng)傷弧菌作為抗原免疫小鼠后，以其他水體常見弧菌屬和非弧菌屬菌株作為檢測(cè)抗原用于雜交瘤細(xì)胞的交叉反應(yīng)試驗(yàn)。篩選到一株特異性分泌抗創(chuàng)傷弧菌抗體的雜交瘤細(xì)胞株3A8，對(duì)其產(chǎn)生單克隆亞型進(jìn)行分型定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IgG1亞型的豐度為66.5%，其余依次為Kappa亞型(22.3%)、 IgM亞型(2.7%)。因此，檢測(cè)表明該抗體屬于IgG1亞型，且效價(jià)在60 000以上，SDS-PAGE顯示抗體分子量為55 kD(圖1)，為斑點(diǎn)雜交法提供了原材料。

注：1為蛋白G結(jié)合后的上清樣品；2為硫酸氨抽提的腹水樣品；3、4為純化的抗體樣品；M為蛋白分子量標(biāo)簽Note:1.Supernatant flowing through protein G；2.Extracted solution of ascite by (NH4)2SO4；3，4.Purified antibody；M.Marker圖1 創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體純化SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE of the purified V. vulnificus antibody

2.2改良斑點(diǎn)雜交法靈敏度根據(jù)文獻(xiàn)[6]采用Western blot化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)代替TMB顯色劑。由圖2可知，改良ECL斑點(diǎn)雜交法對(duì)創(chuàng)傷弧菌的最低檢測(cè)限為1×105CFU/mL，而間接ELISA最低檢測(cè)限為1×107CFU/mL，與之前報(bào)道的檢測(cè)結(jié)果一致[6]。與傳統(tǒng)斑點(diǎn)雜交法及間接ELISA法相比，改良后的ECL介導(dǎo)的斑點(diǎn)雜交法具有更高的靈敏度，較傳統(tǒng)的斑點(diǎn)雜交法的靈敏度高100倍；與間接ELISA法在單菌落(CFU)水平上相比，改良后的ECL介導(dǎo)的斑點(diǎn)雜交法靈敏度較其高1 000倍。

注：創(chuàng)傷弧菌菌液梯度稀釋并固定至硝酸纖維素膜上(5 μL/孔)，以創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體作為一抗，分別以化學(xué)發(fā)光試劑ECL和TMB作為顯色劑。第1行為ECL顯色劑：a～e.分別為1×109 ～1×105 CFU/mL 10倍梯度稀釋創(chuàng)傷弧菌菌液；f為空白對(duì)照。第2行為TMB顯色劑：a～f.分別為1×109 ～1×104 CFU/mL 10倍梯度稀釋創(chuàng)傷弧菌菌液；g為空白對(duì)照。第3行：ELISA分別包被從，加入1∶4 000比例稀釋的創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體作為一抗，a～g.分別為1×108 ～1×102 CFU/mL 10倍梯度稀釋創(chuàng)傷弧菌菌液(100 μL/孔)，h為空白對(duì)照 Note:Sensitivity of V. vulnificus serial dilutions were spotted onto the NCM (5 μL/spot) and conducted dot blot using MAb as the primary antibody. Chemiluminescent reagents ECL and TMB were used as colorants respectively.Row 1，ECL as a colorant:a.1×109 CFU/mL，b.1×108 CFU/mL，c.1×107 CFU/mL，d.1×106 CFU/mL，e.1×105 CFU/mL，f.blank. Row 2，TMB as a colorant:a.1×108 CFU/mL，b.1×107 CFU/mL，c.1×106 CFU/mL，d.1×105 CFU/mL，e.1×104 CFU/mL，f.1×103 CFU/mL，g.blank. Row 3: The ELISA plate was coated with serial dilutions (from 1×108 to 1×102 CFU/mL，100 μL/spot) of V. harveyi，and 1∶4 000 dilutions of MAb was used as the primary antibody. a.1×108 CFU/mL，b.1×107 CFU/mL，c.1×106 CFU/mL，d.1×105 CFU/mL，e.1×104 CFU/mL，f.1×103 CFU/mL，g.1×102 CFU/mL， h.blank圖2 幾種創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體檢測(cè)法靈敏度比較Fig.2 Comparison of the sensitivity of the detection methods of monoclonal antibodies in V. vulnificus

2.3改良斑點(diǎn)雜交法特異性以創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 27562為陽(yáng)性對(duì)照考察了該方法的特異性，并考察是否與水體常見細(xì)菌存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明除與創(chuàng)傷弧菌FD-1株外，與哈維氏弧菌、金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌ATCC17749、副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、陰溝腸桿菌CMCC43501均無交叉反應(yīng)。當(dāng)抗原包被濃度分別為1×108、1×107、1×106、1×105CFU/mL時(shí)，均可檢出創(chuàng)傷弧菌，證明該方法可以用于創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)。

3 討論

創(chuàng)傷弧菌是廣泛分布在世界沿海和河口的病原菌，可感染多種水生動(dòng)物，導(dǎo)致養(yǎng)殖行業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)于創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)顯得尤為重要。目前已報(bào)道的創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)方法主要有PCR檢測(cè)、LAMP以及膠體金免疫層析試紙條法。PCR法雖然能夠較快檢測(cè)出創(chuàng)傷弧菌[8]，但需要特殊的設(shè)備和一定的技能，無法在基層養(yǎng)殖單位進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，而LAMP法雖然不需要特殊設(shè)備，但對(duì)操作環(huán)境要求較高，且易產(chǎn)生假陽(yáng)性。膠體金免疫層析試紙條雖然操作簡(jiǎn)便，但靈敏度最高只能達(dá)1×105CFU/mL，無法用于病害的日常監(jiān)測(cè)。

注：a～e.分別為細(xì)菌濃度為1×108 ～ 1×105 CFU/mL 10倍梯度稀釋菌液固定的樣品；f為空白對(duì)照Note：a～e.Bacterial concentration with 10-fold dilution: 1×108 ～ 1×105 CFU/mL；f. Blank圖3 創(chuàng)傷弧菌改良斑點(diǎn)雜交法靈敏度檢測(cè)Fig.3 Sensitivity detection of the modified speckle hybridization method of V. vulnificus

該研究基于傳統(tǒng)斑點(diǎn)雜交技術(shù)，以靈敏性更好的ECL替代TMB底物顯色液，實(shí)現(xiàn)了創(chuàng)傷弧菌高靈敏度檢測(cè)，與之前報(bào)道的傳統(tǒng)斑點(diǎn)雜交法相比靈敏度提高了100倍，比ELISA法提高了1 000倍，而且反應(yīng)時(shí)間大幅度縮短，孵育時(shí)間從8 h縮短至2 h，可以用于創(chuàng)傷弧菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

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