張立偉，張愛東，譚淑娟，盧思英，李春輝

(1.承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院護(hù)理系,河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科,河北承德 067000)

胃癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均較高，間隙連接蛋白43(Cx43)作為間隙連接通道的組成部分，在Cx家族中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。然而Cx43對(duì)腫瘤組織基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平的下調(diào)機(jī)制尚未完全明確，成為目前研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞骨架連接蛋白(Ezrin)連接著細(xì)胞膜分子與肌動(dòng)蛋白絲，且發(fā)揮重要作用的是細(xì)胞的生長過程中磷酸化的Ezrin(P-Ezrin)，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)生物行為的異常，從而參與腫瘤的發(fā)生過程。目前，聯(lián)合研究Cx43與P-Ezrin在胃癌中的表達(dá)及相關(guān)性的研究尚未見報(bào)道。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年2月至2016年10月期間承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)的胃癌手術(shù)標(biāo)本110例，同時(shí)選取40例距腫瘤5 cm以上的正常胃組織作對(duì)照組，患者在術(shù)前均未接受抗癌治療。110例胃癌患者中，男69例，女41例，年齡27～82歲，平均(54.3±5.4)歲；>50歲68例，≤50歲42例。

1.2試劑 (1)免疫組織化學(xué)試劑：鼠抗人Cx43、P-Ezrin 一抗抗體、免疫組織化學(xué)MaxVision試劑盒和即用型DAB顯色試劑盒(DAB-0031)購自福州邁新公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、蘇木素、伊紅等常規(guī)試劑購自北京化學(xué)試劑公司。(2)Western blot所用試劑：兔抗人一抗Cx43及P-Ezrin 抗體購自Bioword Technology公司，羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗購自KPL試劑公司，RIPA組織裂解液(BB120031)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、BCA蛋白濃度測定試劑盒及ECL超敏發(fā)光液均購自北京索萊寶科技有限公司，30%丙烯酰胺、10%過硫酸銨、顯影粉等均由承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所分子實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué) 石蠟包埋標(biāo)本4 μm連續(xù)切片，行蘇木素-伊紅(HE)和免疫組織化學(xué)染色。3% H2O2孵育10 min封閉滅活內(nèi)源性過氧化酶；0.01 mol/L(pH 6.0)枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(fù)抗原10 min；山羊血清工作液37 ℃封閉溫育60 min；37 ℃濕盒中滴加適當(dāng)濃度一抗，溫育60 min后4 ℃過夜；酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物(二抗)室溫孵育15 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染核。PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，已知正常胃組織的陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.3.2Western blot 取-20 ℃保存的組織提取總蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。每孔上樣量為20 μg,電泳、轉(zhuǎn)膜、放入含5%脫脂奶粉封閉液中封閉；在裝有稀釋好的Ⅰ抗雜交袋中過夜，TBST洗膜3次，每次15 min；加Ⅱ抗孵育2 h后用1×TBST洗膜3次，每次5 min，曝光，觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1Cx43與P-Ezrin的免疫組織化學(xué)結(jié)果 40例對(duì)照組的標(biāo)本中，Cx43陽性率為65.0%(26/40)，顯著高于胃癌組19.1%(21/110)。P-Ezrin陽性率為27.5%(11/40)，顯著低于胃癌組74.5%(82/110)，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2，表1。

A:正常胃黏膜強(qiáng)陽性;B:胃高分化腺癌中等陽性;C:胃低分化腺癌弱陽性。

圖1不同組織中Cx43表達(dá)情況(×400)

A:正常胃黏膜陰性;B:胃高分化腺癌弱陽性;C:胃低分化腺癌強(qiáng)陽性。

圖2不同組織中P-Ezrin表達(dá)情況(×400)

表1 兩組Cx43與P-Ezrin表達(dá)情況

表2 Cx43與P-Ezrin的表達(dá)與胃腺癌臨床病理特征的定性分析

2.2Cx43及P-Ezrin表達(dá)分析 在40例對(duì)照組的胃組織標(biāo)本中，Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.95±0.02)高于胃癌組織(0.12±0.03)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)，P-Ezrin蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.29±0.03)低于胃癌組織(2.43±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)，在性別和年齡組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在其余各組中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、3，圖3。

表3 Cx43、P-Ezrin表達(dá)與胃腺癌臨床特征的定量分析

1:對(duì)照組;2:高中分化胃癌組;3:低分化胃癌組。

圖3不同組Cx43、P-Ezrin免疫印跡電泳

表4 Cx43與P-Ezrin在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)分析

2.3Cx43、P-Ezrin在胃癌中的相互關(guān)系 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果中Cx43與P-Ezrin在胃癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.58，P=0.000),見表4。

3 討 論

間隙連接是細(xì)胞間進(jìn)行信息交流的特殊膜結(jié)構(gòu)，其功能和結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)是間隙連接蛋白。有資料證實(shí)，Cx43在多種組織中表達(dá)[1]，如上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌組織等，但在惡性腫瘤組織中卻表達(dá)減少甚至缺失[2-5]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，癌旁組織中Cx43蛋白表達(dá)遠(yuǎn)高于胃癌組織，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與患者年齡及性別無關(guān)，而與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度、臨床分期有關(guān)，提示Cx43的缺失可能促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。

Ezrin是參與細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架連接的一種特定蛋白[6]。磷酸化作用使Ezrin構(gòu)象發(fā)生改變而激活，P-Ezrin介導(dǎo)后續(xù)的病理生理過程。Ezrin在將肌動(dòng)蛋白絲與細(xì)胞膜相連的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列細(xì)胞功能，如細(xì)胞的形態(tài)改變、移動(dòng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、黏附、有絲分裂等，從而影響了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。因此，越來越多的研究證實(shí)，Ezrin在多種腫瘤中存在高表達(dá)[7-10]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相一致。在進(jìn)一步探討P-Ezrin表達(dá)與惡性腫瘤臨床病理特征關(guān)系中，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)P-Ezrin與多類惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-12]，且腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力在P-Ezrin低表達(dá)時(shí)受到抑制，反之則增強(qiáng)。顯示P-Ezrin是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，并且是預(yù)后差的指標(biāo)[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示P-Ezrin在胃癌中的表達(dá)與患者性別和年齡無關(guān)，而與胃癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)，低表達(dá)者分化程度高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少、腫瘤浸潤深度淺、臨床分期低。進(jìn)一步證實(shí)了P-Ezrin在參與了胃癌的發(fā)生過程，有高侵襲和轉(zhuǎn)移傾向。

Cx43在胃癌組織中的表達(dá)明顯下降，P-Ezrin的表達(dá)則明顯增加，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這可能是由于P-Ezrin自身或通過激活各種信號(hào)分子導(dǎo)致 Cx43 磷酸化，從而破壞了細(xì)胞間的通信功能，導(dǎo)致細(xì)胞間生長控制減弱，這種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)作用，可能是胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，可能成為胃癌藥物治療的潛在作用靶點(diǎn)，但具體機(jī)制還有待于研究。

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