譚燕萍，李彩蘭，談麗華，蘇子仁△

(1.廣東省佛山市禪城區(qū)朝陽醫(yī)院藥劑科 528000；2.廣州中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東廣州 510006)

黃連為毛莨科植物黃連、三角葉黃連和云連的干燥根莖，黃柏為蕓香科植物黃皮樹或黃檗的干燥樹皮。黃連、黃柏不僅在中國傳統(tǒng)中醫(yī)治療中具有很高的藥用價值,而且在國際中醫(yī)藥市場上占據(jù)重要地位，含有黃連、黃柏成分的藥物也不斷被研制。二黃消炎片是佛山市禪城區(qū)朝陽醫(yī)院藥劑科研發(fā)的中藥片劑，由黃連、黃柏、白花蛇舌草、蒲公英、白術、丹參、炙甘草七味藥組成，具有清熱燥濕、健脾和胃的功效，臨床上用于慢性胃炎的治療。方中黃連、黃柏苦寒清熱燥濕[1]，現(xiàn)代藥理研究表明，黃連、黃柏具有抗幽門螺桿菌、治療慢性胃炎的作用，是該方的主要藥物[2-4]。但是，由于該制劑含七味中藥，且每種中藥所含成分眾多，干擾大，目前對其質(zhì)量標準的相關研究暫無文獻報道。研究顯示，黃連、黃柏的藥理活性主要與其所含的多種季胺型異喹啉類生物堿有關[5-6]，包括小檗堿、黃連堿、表小檗堿、巴馬汀、藥根堿等，其中以小檗堿的含量最高。因此，本研究擬建立同一色譜條件下分離測定二黃消炎片中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿這5種異喹啉類生物堿的方法，并進行方法學的考察[7-15]，為二黃消炎片的質(zhì)量控制提供定量指標依據(jù)，從而保證該制劑的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1儀器 島津LC solution-20A高效液相色譜儀；舒美KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，效率：40 kHZ，功率：500 W)；SHIMADZU AUY120萬分之一天平(廣州湘儀機電設備有限公司)；Sartorius BP211D十萬分之一天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2試劑與試藥 小檗堿對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號為110713-200910；巴馬汀，黃連堿及表小檗堿對照品均由成都純化標準生物公司提供，批號分別為140910、140305、150106；藥根堿由成都普菲德生物公司提供，批號為140507；二黃消炎片(批號20161102、20161104、20161106、20161108、20161110、20161112)由佛山市禪城區(qū)朝陽醫(yī)院提供；乙腈為色譜純試劑(Honey-well公司)、水為超純水、其他試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1色譜條件 YMC-Pack ODS-AM色譜柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；以0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)-乙腈(B)流動相梯度洗脫[0～20 min (20% B)，20～25 min (20%～30% B)，25～40 min (30%～33% B)，40～45 min (33%～20% B)]；流速為0.4 mL/min；進樣量為10 μL；檢測波長為345 nm；柱溫為27 ℃。理論板數(shù)按小檗堿峰計算應不低于4 000。

1.3.2溶液的配制

1.3.2.1對照品溶液制備 分別取小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿，精密稱定，加甲醇溶解，制成每毫升含與供試品溶液質(zhì)量濃度相當?shù)膶φ掌坊旌先芤?小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿的質(zhì)量濃度分別為0.381 6、0.100 8、0.077 4、0.027 8、0.040 6 mg/mL)，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

1.3.2.2供試品溶液制備 取質(zhì)量差異下的二黃消炎片數(shù)片，除去薄膜衣，研磨，取細粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱質(zhì)量，超聲處理30 min (功率：500 W，頻率：40 kHz)，放冷，密塞，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

1.3.2.3陰性樣品溶液制備 按二黃消炎片的制備工藝制得不含黃連的陰性樣品，按“1.3.2.2”方法制得陰性樣品溶液。

1.3.3方法學考察

1.3.3.1專屬性考察 分別取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，在“1.3.1”項色譜條件下進行測定，記錄色譜圖。

1.3.3.2線性關系考察 精密吸取“1.3.2.1”項制備的對照品溶液4、6、8、10、12、14 μL，注入高效液相色譜儀，按“1.3.1”項色譜條件測得峰面積，并以峰面積(Y)與進樣量(X)繪制標準曲線并進行線性回歸。

1.3.3.3精密度試驗 精密吸取“1.3.2.1”制備的小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿對照品混合溶液10 μL，按“1.3.1”項色譜條件重復進樣6次，測定峰面積并計算其相對標準偏差(RSD)值。

1.3.3.4重復性試驗 取同一批號的二黃消炎片(批號：20161102)，按“1.3.2.2”方法平行制備6份供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件測定各成分的質(zhì)量分數(shù)并計算其RSD值。

1.3.3.5穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液(批號：20161102)，在相同的條件下分別于0、2、4、8、12 h進樣測定，記錄各化合物的峰面積并計算其RSD值。

1.3.3.6加樣回收率試驗 取同一批號(批號：20161102)已知質(zhì)量分數(shù)的二黃消炎片約0.25 g，精密稱定，共6份，精密加入“1.3.2.1”標準品混合溶液12.5 mL，揮干，按“1.3.2.2”方法制備供試品溶液，并根據(jù)“1.3.1”色譜條件進行測定，計算回收率及其RSD值。

1.3.3.7樣品測定 取6個不同批次的二黃消炎片，按“1.3.2.2”方法制備供試品溶液，并根據(jù)“1.3.1”色譜條件對6批樣品進行含量測定，計算其RSD值。

2 結(jié) 果

2.1專屬性考察 小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿峰型基本對稱，各色譜峰之間均較好分離,出峰時間分別為35.899、35.297、32.978、31.469及30.305 min。而陰性樣品溶液在對照品相同的保留時間位置上未見色譜峰，說明二黃消炎片中其他成分對測定的成分無干擾，見圖1。

2.2線性關系考察 以峰面積(Y)與進樣量(X)繪制標準曲線并進行線性回歸分析，得回歸方程如下。小檗堿：Y=238 831.536 4X+578.640 0，r=0.999 9，線性范圍為1.526 4～5.342 4 μg；巴馬?。篩=306 532.029 5X-61 887.000 0，r=0.999 6，線性范圍為0.403 2～1.411 2 μg；黃連堿：Y=229 732.627 2X+1 264.400 0，r=0.999 8，線性范圍為0.309 7～1.083 9 μg；藥根堿：Y=300 527.749 2X+479.460 0，r=0.999 8，線性范圍為0.111 2～0.389 2 μg；表小檗堿：Y=214 131.407 4X-619.260 0，r=0.999 6，線性范圍為0.162 2～0.567 7 μg。結(jié)果表明小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿分別在1.526 4～5.342 4 μg，0.403 2～1.411 2 μg，0.309 7～1.083 9 μg，0.111 2～0.389 2 μg，0.162 2～0.567 7 μg的范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

A:對照品溶液；B：供試呂溶液；C：陰性樣品溶液

圖1對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液的HPLC圖譜

2.3精密度試驗 精密度試驗結(jié)果表明小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿的平均峰面積分別為951 214.17(RSD為1.1%)，249 328.33(RSD為1.9%)、183 544.17(RSD為1.1%)、85 685.17(RSD為1.6%)、88 861.17(RSD為1.7%)，表明該儀器精密度良好。

2.4重復性試驗 重復性試驗測得同一批號的二黃消炎片中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿的平均質(zhì)量分數(shù)分別為19.970 0 mg/g(RSD為1.1%)、5.060 0 mg/g(RSD為1.1%)、3.930 0 mg/g(RSD為1.5%)、1.400 0 mg/g(RSD為1.5%)、2.050 0 mg/g(RSD為1.9%)，表明該方法的重復性良好。

2.5穩(wěn)定性試驗 結(jié)果測得小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿的平均峰面積分別為961 432.60(RSD為1.5%)、249 370.40(RSD為2.0%)、179 799.20(RSD為0.9%)、83 966.20(RSD為1.7%)、85 918.00(RSD為1.9%)，表明該供試品溶液在12 h內(nèi)能夠保持穩(wěn)定。

2.6加樣回收率試驗 小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿的平均回收率分別為98.69%(RSD為1.1%)，98.66%(RSD為1.1%)，98.67%(RSD為1.1%)，98.67%(RSD為1.1%)，98.67%(RSD為1.1%)，見表1。

2.7樣品測定 取6個不同批次的二黃消炎片，按“1.3.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”項色譜條件對6批樣品進行測定，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=6)

3 討 論

3.1提取溶劑的選擇 由2015版《中華人民共和國藥典》[1]得知提取黃連中生物堿的溶劑為用甲醇-鹽酸 (100∶1)，故本研究選用甲醇、不同配比甲醇-鹽酸溶液作為提取溶劑比較提取的效果，發(fā)現(xiàn)甲醇及甲醇-鹽酸溶液的提取效果相差不大，因此本研究從提取方法的簡便性考慮，選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2超聲時間的選擇 考慮到制劑檢驗時的簡便性及2015版《中華人民共和國藥典》[1]中檢測方法的記載，本研究采用超聲( 功率500 W，頻率40 kHz) 提取方法進行試驗，對提取時間進行考察(10、20、30、40、50、60 min)，結(jié)果顯示隨著超聲時間增加提取效率逐漸提高，但30 min以后提取結(jié)果相差不大，因此本研究提取樣品的超聲時間為30 min。

3.3波長的選擇 分別取小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿對照品溶液在200～400 nm波長內(nèi)進行紫外掃描比較。掃描顯示物種異喹啉類生物堿在345 nm波長處均有較大吸收，因此選擇345 nm的波長作為測定這5種成分的吸收波長。

3.4流動相的選擇 本研究中流動相體系是在查閱文獻[8-10]及試驗基礎上建立的，可對二黃消炎片中5種異喹啉類生物堿進行同時測定，分離度均大于1.5，以小檗堿計理論塔板數(shù)大于5 000。

本研究所建立的同時測定二黃消炎片中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、藥根堿及表小檗堿的含量測定方法可行性高，專屬性強，準確性高，重現(xiàn)性好，可作為該制劑質(zhì)量的控制標準之一。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部) [M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[2]吳靜，王克霞，胡聯(lián)華．黃連對幽門螺桿菌的體外抗菌活性研究[J]．時珍國醫(yī)國藥，2006，17(12)：2486-2487．

[3]姚希賢,王丙信.對幽門螺桿菌有效中西藥物篩選的實驗研究[J].胃腸病學和肝病學雜志,1995,4(4):267-270.

[4]宋江林,程督劍,羅敏.黃連為主治療慢性胃炎59例[J].湖南中醫(yī)雜志,2003,30(4):32.

[5]李彩虹,周克元.黃連活性成分的作用及機制研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(2):466-468.

[6]李小玲.黃連及其有效組分小檗堿的生物活性研究[D].武漢：湖北師范學院,2013.

[7]陳劍平,李一圣,盧小鳳,等.反相高效液相色譜法同時測定黃術健胃片中野黃芩苷、鹽酸小檗堿及丹皮酚的含量[J].藥物分析雜志,2010，30(11):2157-2159.

[8]侯建忠，喻利堅，楊鋮．HPLC測定舒通安泰膠囊中小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀含量[J]．中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21(7)：61-63.

[9]張華，劉敏，李忠東．HPLC法測定芩連平胃湯中小檗堿,表小檗堿,黃連堿,巴馬汀含量[J]．遼寧中醫(yī)藥大學學報，2014，16(12)：56-57.

[10]胡遠艷，田建平．清胃黃連片中鹽酸小檗堿、藥根堿、巴馬汀的含量測定[J]．廣州化工，2012，40(16)：122-124.

[11]孫建彬，王欣，陽勇，等．黃連須中5種生物堿含量的高效液相色譜法測定[J]．時珍國醫(yī)國藥，2015，26(7)：1607-1609．

[12]賴先榮，周邦華，杜明勝，等．6 種黃連飲片中6 種生物堿的RP-HPLC 含量測定及與“治消渴”藥效學的譜-效關系分析[J]．中國中藥雜志，2016，41(24)：4579-4586．

[13]荊婧，李明玉，陳桂榮，等．HPLC法測定黃連解毒湯及其有效組分群中5種化學成分含量[J]．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12(9)：20-23．

[14]袁學剛，王戰(zhàn)國，胡慧玲，等．HPLC測定連梔礬溶液中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量[J]．中藥與臨床，2016，7(1)：31-33．

[15]陽勇，羅維早，孫建彬，等．HPLC 法測定黃連藥材及其炮制品中六種生物堿的含量[J]．世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17(3)：596-602．