茅肖娜，汪莉莉

(浙江省寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院檢驗科 315000)

胰腺癌是一種惡性程度和病死率極高的癌癥之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅著患者的生命安全[1-2]。胰腺癌在病情早期無明顯癥狀，多數(shù)患者在確診時病情已進展至喪失根治性切除時機，加上胰腺在解剖結(jié)構(gòu)上毗鄰關(guān)系復(fù)雜，穿刺活檢操作難度大[3]；且胰腺癌具有明顯的侵襲性生物學(xué)行為[4]，因此目前主要的診斷手段穿刺活檢對胰腺癌的臨床應(yīng)用價值非常有限，迫切需要尋求一種能夠在較為早期提示病情且便于操作的診斷方法[5]。檢測血液中的腫瘤標(biāo)志物在目前惡性疾病的篩查和診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用。有研究報道顯示，CA199是一種糖蛋白腫瘤標(biāo)志物，在胰腺癌患者的血清中水平增加明顯，是目前對胰腺癌診斷最為常用的腫瘤標(biāo)志物[6]，但其特異度和敏感度均不甚理想[7]。隨著研究的不斷深入，有研究發(fā)現(xiàn)多種惡性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都伴隨著微小RNA(miRNA)的表達變化，miRNA近年來也被作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物受到了研究者的普遍關(guān)注，已有研究指出miR-21對胰腺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[8-9]。因此，本研究通過檢測胰腺癌患者血清中的miR-21和CA199的表達情況，并評價其對胰腺癌的診斷價值，旨在為臨床實踐提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2016年6月在本院就診的胰腺癌患者124例(癌癥組)，良性胰腺疾病患者100例(良性對照組)及同期健康體檢者100例(健康對照組)作為觀察對象。其中，癌癥組男59例，女65例，年齡47～72歲，平均(52.7±12.8)歲；良性對照組男51例，女49例，年齡45～76歲，平均(53.9±11.6)歲；健康對照組男53例，女47例，年齡43～74歲，平均(54.2±14.3)歲。所有疾病患者均經(jīng)病理學(xué)確診，且入組前未行放療化療及其他免疫療法，健康對照組患者的所有體檢指標(biāo)均正常。經(jīng)統(tǒng)計分析，3組患者的年齡及性別構(gòu)成比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具有可比性。所有研究對象對本研究均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法 采集所有研究對象的空腹靜脈血，2 h內(nèi)在4 ℃低溫離心機中以4 000 r/min離心10 min，分離血清置于4 ℃保存待測。其中用于檢測miRNA的血清樣本再次以12 000 r/min離心10 min以確保血清樣本中不含任何細胞碎片，置于不含RNA酶的EP管中待測。CA199采用瑞士Roche公司的全自動生化分析儀E170模塊及其配套試劑檢測，嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程進行操作，正常參考值范圍小于或等于37 U/mL。miR-21采用德國Qiagen公司提供的miRNeasy Serurn/Plasma試劑盒，按照操作說明書進行，提取200 mL血清中的總RNA并使用脫氧核糖核酸酶(RnaseⅠ)酶解后，使用QIAGEN miScript Reverse Transcripition Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明書進行操作，最后使用瑞士Roche公司的Real time PCR儀LightCycler Ⅱ480進行檢測，選擇Absoulute Quantification，PCR起始-反應(yīng)條件為95 ℃ 15 min；而后依次為94 ℃ 15 s變性、55 ℃ 30 s退火、70 ℃ 30 s延伸3步循環(huán)，共循環(huán)40次。內(nèi)參為RNU6，待測樣品和內(nèi)參同時擴增，在96孔板中每個樣品各重復(fù)3次，平均Ct值作為樣品的結(jié)果Ct值。

2 結(jié) 果

2.1不同組別人群miR-21與CA199表達情況比較 癌癥組患者的CA199和miR-21表達量均顯著高于良性對照組和健康對照組(P<0.05)，且良性對照組CA199表達量也顯著高于健康對照組(P<0.05)，而miR-21在良性對照組和健康對照組間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同組別人群miR-21與CA199表達情況比較

a:P<0.05，與良性對照組比較；b:P<0.05，與健康對照組比較

2.2CA199與miR-21對鑒別健康人群和胰腺癌患者的診斷價值情況 單獨用于鑒別健康人群和胰腺癌患者時，CA199的敏感度和特異度均不高，分別為63.71%和56.00%，均顯著低于miR-21的敏感度和特異度(79.84%和78.00%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)兩者聯(lián)合時，其靈敏度和特異度較單獨使用時有顯著升高，曲線下面積明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2、圖1。

表2 CA199與miR-21對區(qū)分健康人群和胰腺癌患者的診斷價值情況

a:P<0.05，與CA199比較；b:P<0.05，與miR -21比較

圖2 CA199與miR-21對鑒別健康人群和胰腺癌患者的ROC曲線

2.3CA199與miR-21對鑒別良性胰腺疾病和胰腺癌患者的診斷價值情況 單獨用于鑒別良性胰腺疾病和胰腺癌患者時，CA199的敏感度和特異度分別為53.23%和51.00%，均顯著低于miR-21的敏感度和特異度(72.58%和74.00%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)兩者聯(lián)合時，其靈敏度和曲線下面積較單獨使用有明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但特異度與單用miR-21比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3、圖2。

表3 CA199與miR-21對鑒別良性胰腺癌疾病和胰腺癌患者的診斷價值情況

aP<0.05，與CA199比較；bP<0.05，與miR -21比較

圖2 CA199與miR-21對區(qū)分良性胰腺癌疾病和胰腺癌患者的ROC曲線

3 討 論

胰腺癌是一種惡性程度和病死率都很高的疾病，現(xiàn)已成為消化系統(tǒng)惡心疾病導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康[10]。手術(shù)切除是目前惟一可能治愈胰腺癌的治療手段，然而如前文所述，胰腺癌患者在發(fā)病早期并無明顯的臨床癥狀或體征，更無特異性表現(xiàn)，加上胰腺解剖位置毗鄰臟器多，組織活檢的應(yīng)用受到限制[11]。目前胰腺癌的診斷主要依賴于影像學(xué)檢查，但對胰腺癌診斷的敏感度和特異度不甚理想，尤其是難以發(fā)現(xiàn)早期病變。多種原因使得多數(shù)患者在確診時已發(fā)展至病情晚期而失去了手術(shù)切除的機會，因此臨床迫切需要探尋更為簡便的篩查和診斷胰腺癌的技術(shù)手段。

CA199是目前臨床應(yīng)用較為普遍的一種篩查胰腺癌的腫瘤標(biāo)志物，已有諸多研究報道指出CA199對胰腺癌的診斷具有較好的敏感度和特異度，且根據(jù)胰腺癌患者血清CA199的水平對判斷胰腺癌手術(shù)患者的預(yù)后及術(shù)后復(fù)發(fā)情況也具有較好的預(yù)測價值[12]。但也有研究指出CA199表達升高缺乏特異性，可見于多種疾病，如肝膽疾病或良性胰腺疾病等，且有數(shù)據(jù)指出約有30%的胰腺癌患者可不出現(xiàn)血漿中CA199表達增高[13]。本研究中的數(shù)據(jù)也顯示，CA199在胰腺癌患者和良性胰腺疾病患者均有高表達，在區(qū)分健康人群與胰腺癌患者、良性胰腺疾病患者與胰腺癌患者方面，其敏感度和特異度均不高，這使得CA199對胰腺癌診斷的應(yīng)用價值受到限制。因此，在臨床實踐中仍需要聯(lián)合其他指標(biāo)。

關(guān)于CA199與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用于診斷胰腺癌的臨床研究，近年來已有較多的相關(guān)報道，如將CA199與miRNA聯(lián)合時，可明顯提高對良性胰腺疾病與胰腺癌的診斷敏感度和特異度，且有助于早期診斷胰腺癌[14]。諸多研究已證實多種miRNA在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中的起著重要作用[15-17]，在此不做贅述。研究表明，miR-21在胰腺癌患者中表達明顯升高，指出miR-21是一種胰腺癌化療相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，且其高表達往往預(yù)示著預(yù)后差，在預(yù)測患者預(yù)后方面具有潛在的應(yīng)用價值[18]。潘文征等[19]研究共檢測了胰腺癌患者血漿中6種miRNA(分別是miR-21、miR-210、miR-155、miR-196a、miR-20a、miR-25)的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-21對胰腺癌的單獨診斷價值最高。郭學(xué)青等[20]新近報道的研究數(shù)據(jù)顯示miR-21對于胰腺癌具有一定的輔助診斷價值，與CA199聯(lián)合檢測可以為臨床胰腺癌的診斷提供一種潛在的輔助診斷方法。但該研究未比較CA199與miR-21在單用時的診斷價值，且該研究中發(fā)現(xiàn)miR-21在良性胰腺疾病中也有顯著升高，與劉建強等[21]報道的數(shù)據(jù)存在一定的矛盾，究其原因，可能與兩項研究納入的病例數(shù)均較小有關(guān)，且其他研究也指出miR-21對胰腺癌的診斷價值仍需要進一步多中心大樣本的研究加以證實[22]。為了進一步探討miR-21的應(yīng)用價值，因此本研究分析了miR-21與CA199聯(lián)合應(yīng)用時對胰腺癌的診斷價值。結(jié)果顯示，胰腺癌患者的miR-21表達量顯著高于良性胰腺疾病患者和健康對照人群，而在良性胰腺疾病患者和健康對照人群之間，其表達量未見明顯差異，這一結(jié)果提示miR-21對篩查胰腺癌具有一定的特異性；在診斷價值方面，本研究分別從區(qū)分健康人群和胰腺癌患者、良性胰腺疾病和胰腺癌患者兩個角度分析比較CA199與miR-21及其聯(lián)合使用時的診斷價值，結(jié)果顯示miR-21的敏感度和特異度均優(yōu)于CA199，其診斷價值更高，兩者聯(lián)合應(yīng)用有助于提高對胰腺癌的診斷價值。

綜上所述，當(dāng)前胰腺癌的診斷和治療水平仍未達到臨床需求，尤其是提高胰腺癌早期診斷能力仍然是目前臨床迫切而具有挑戰(zhàn)的難題。CA199作為目前應(yīng)用較為廣泛的一種腫瘤標(biāo)志物，其敏感度和特異度欠佳；miR-21是新近發(fā)現(xiàn)的一種標(biāo)志物，其診斷價值優(yōu)于CA199，兩者聯(lián)合應(yīng)用有助于提高對胰腺癌的診斷鑒別能力。

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