曾 文，秦 雯，胡大春，李梅華，唐樹榮

(云南省昆明市第一人民醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.輸血科;3.呼吸科 650011)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種吸入有害氣體或顆粒產(chǎn)生異常慢性炎性反應(yīng)導(dǎo)致氣道受阻繼而發(fā)展為慢性氣管炎或伴隨肺氣腫的慢性疾病[1]。我國(guó)40歲以上人群的患病率高達(dá)8.2%[2]。預(yù)計(jì)到2020年，該病將成為世界第3位致死原因[3]，將位居世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)第5位，是嚴(yán)重影響公共健康水平的重要疾病之一。COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未明了。已有的研究提示多種免疫機(jī)制失衡參與其中,尤其是Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T lymphocytes，Treg)等細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)改變突出[4-7]。COPD動(dòng)物模型研究顯示Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞水平變化顯著[8]。T淋巴細(xì)胞是一群異質(zhì)性細(xì)胞的總稱，均表達(dá)CD3分子，包括CD4+、CD8+、CD3+CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞(double negative T cell，DNT)等。依據(jù)其功能分為輔助性T細(xì)胞(Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞)，具有抑制性功能的Treg、細(xì)胞毒T細(xì)胞等。它們通過(guò)細(xì)胞因子及其信號(hào)通路相互協(xié)助與相互制約，維持機(jī)體免疫動(dòng)態(tài)平衡。先前的臨床研究文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)COPD疾病狀態(tài)下，有關(guān)這些免疫細(xì)胞間及其與細(xì)胞因子間相互作用機(jī)制變化的闡述并不多見。為更深入理解COPD患者免疫機(jī)制的變化，以便臨床更好地實(shí)施COPD免疫輔助治療，預(yù)防急性加重期COPD(AECOPD)的發(fā)生、延緩病程進(jìn)展，本研究選擇COPD急性加重期患者48例和健康對(duì)照者30例，對(duì)外周血各類T淋巴細(xì)胞和相關(guān)的細(xì)胞因子的變化進(jìn)行檢測(cè)與多因素分析，初步探討了COPD細(xì)胞免疫機(jī)制的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年12月本院收治的48例AECOPD患者作為研究組。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合美國(guó)呼吸病學(xué)會(huì)2009年修訂的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，并符合AECOPD的定義，即穩(wěn)定期COPD患者急性起病、呼吸系統(tǒng)癥狀惡化,表現(xiàn)為呼吸困難、咳嗽、痰量最多或/和痰液呈膿性，臨床或/和實(shí)驗(yàn)室檢查沒有發(fā)現(xiàn)其他可以解釋的特異病因，導(dǎo)致需要改變藥物治療。(2)近3個(gè)月未患其他部位的感染性疾病。排除自身免疫病、糖尿病、腫瘤、各種慢性消耗性疾病及肝腎功能嚴(yán)重受損者、免疫抑制劑治療者。其中男27例，女21例，年齡51～82歲，平均66.5歲。同時(shí)抽取30例健康體檢者作為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往健康，無(wú)慢性呼吸系統(tǒng)疾病史；(2)近3個(gè)月未患感染性疾??；(3)血、尿、便常規(guī)及X線片檢查正常。其中男13例，女17例，年齡20～50歲，平均35.0歲。本研究獲得了本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；研究病例和對(duì)照者選取中，已告知研究對(duì)象本研究目的、內(nèi)容，可能造成的明顯和潛在不利影響，經(jīng)知情同意后入選。

1.2儀器與試劑 儀器：細(xì)胞免疫項(xiàng)目采用貝克曼庫(kù)爾特FC-500流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞因子項(xiàng)目采用Thermo酶標(biāo)儀檢測(cè)。試劑：細(xì)胞免疫項(xiàng)目試劑(熒光抗體CD4-FITC，CD127-PE，CD25-PC5，CD3-PC5，CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5)、標(biāo)準(zhǔn)熒光微球(flowcheck)及室內(nèi)質(zhì)控品由貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)。熒光抗體anti-IL-17-PE由eBiosciences公司生產(chǎn)。流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)(FACS)溶血?jiǎng)┯葿D公司生產(chǎn)。細(xì)胞因子項(xiàng)目試劑由Dldevelop公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1樣本采集與處理 用BD公司生產(chǎn)真空采集管，空腹采集靜脈血1管(肝素鋰抗凝管)，采集量2 mL、無(wú)抗凝血3 mL，前者24 h內(nèi)進(jìn)行處理和上機(jī)檢測(cè)，后者2 h內(nèi)離心分離血清，-80 ℃保存。樣本處理過(guò)程中，排除嚴(yán)重溶血，黃疸和脂血樣本。

1.3.2CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、DNT細(xì)胞檢測(cè) 先將10 μL熒光抗體CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5加入到標(biāo)準(zhǔn)流式管底，再將100 μL抗凝血加入流式管中，輕輕混勻，室溫避光孵育30 min，然后加入FACS溶血?jiǎng)┕ぷ饕? mL，避光溶血15 min后，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞，混勻后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用4色分析，CD45-SS設(shè)門。

1.3.3Treg檢測(cè) 先將10 μL熒光抗體CD4-FITC，CD127-PE，CD25-PC5加入到標(biāo)準(zhǔn)流式管底，再將100 μL抗凝血加入流式管中，輕輕混勻，室溫避光孵育30 min，然后加入FACS溶血?jiǎng)┕ぷ饕? mL，避光溶血15 min后，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，混勻后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用3色分析，CD4-SS設(shè)門。CD4+CD25+CD127low細(xì)胞群為Treg。

1.3.4Th17細(xì)胞檢測(cè) 分離收集外周血單個(gè)核細(xì)胞，置入標(biāo)準(zhǔn)流式管中并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，加入細(xì)胞刺激液，5%濃度CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中放置8 h后，用PBS清洗細(xì)胞，PBS重懸。加入10 μL熒光抗體CD4-FITC、CD3-PC5、anti-IL-17-PE后避光4 ℃孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用3色分析，CD3-SS設(shè)門。

1.3.5細(xì)胞因子的檢測(cè) IL-12、IL-22、IL-23R、IL-23、TNF-α均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)雙抗體夾心法進(jìn)行檢測(cè)。按照試劑說(shuō)明書配制好酶標(biāo)抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、清洗液；將標(biāo)準(zhǔn)品逐倍稀釋成7個(gè)濃度(1∶2～1∶64)后和樣本一起逐個(gè)加入相應(yīng)酶標(biāo)孔。封板37 ℃孵育1 h后，加入酶標(biāo)抗體，37 ℃孵育1 h后顯色15 min，終止反應(yīng)后使用酶標(biāo)儀讀取各酶標(biāo)孔吸光度(OD)值，并用軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合計(jì)算。

1.3.6肺功能檢查 由本院呼吸科肺功能檢查室完成，設(shè)備為德國(guó)耶格APS-PRO肺功能檢查儀。選用用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼出量(FEV1.0)、FEV1.0/ FVC比值為肺功能分析指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1各類T細(xì)胞水平的變化 研究組與對(duì)照組人群外周血CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD8+T細(xì)胞、DNT、Treg、Th17細(xì)胞百分比檢測(cè)結(jié)果見表1。研究組外周血CD8+T細(xì)胞水平較對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Treg、Th17細(xì)胞水平較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值和DNT水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2外周血細(xì)胞因子水平的變化 研究組與對(duì)照組人群外周血細(xì)胞因子IL-12、IL-22、IL-23、IL-23R、和TNF-α水平檢測(cè)結(jié)果見表2。所檢測(cè)的5種細(xì)胞因子在研究組患者外周血中水平較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3T細(xì)胞及細(xì)胞因子間的相關(guān)性變化 研究組與對(duì)照組人群外周血T細(xì)胞及細(xì)胞因子間的相關(guān)性分析中，兩組間存在相關(guān)性改變的結(jié)果見表3、4、5。其中：(1)研究組CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞、Th17與CD3+T細(xì)胞、Th17與CD8+T細(xì)胞無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，但對(duì)照組為負(fù)相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(2)研究組Th17與Treg為負(fù)相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但對(duì)照組為正相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(3)研究組IL-23與CD4+T細(xì)胞、TNF-α與DNT無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但對(duì)照組為正相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(4)研究組IL-22與IL-23為正相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但對(duì)照組無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其余相關(guān)性在同向存在相關(guān)程度的差異。

表2 2組人群細(xì)胞因子水平分布[M(Q25,Q75)]

表3 兩組患者T細(xì)胞間相關(guān)性變化

表4 兩組患者Th17與其他T細(xì)胞相關(guān)性的變化

表5 兩組患者細(xì)胞因子間及與T細(xì)胞相關(guān)性的變化

2.4AECOPD患者T細(xì)胞及細(xì)胞因子潛在聯(lián)系分析 用因子分析方法對(duì)研究組和對(duì)照組13項(xiàng)觀察指標(biāo)進(jìn)行潛在聯(lián)系的分析，研究組和對(duì)照組分別存在5個(gè)公因子(即主成分)，其總方差解釋度分別為75.74%和77.89%。研究組和對(duì)照組5個(gè)主成分的特征值見表6。進(jìn)入5個(gè)主成分的觀察指標(biāo)(負(fù)荷變量)及其系數(shù)與得分見表7、8。研究組與對(duì)照組比較，進(jìn)入5個(gè)主成分的負(fù)荷變量發(fā)生了變化。

表6 2組主成分特征值

表7 研究組慢性阻塞性肺病急性加重期患者T細(xì)胞及細(xì)胞因子主成分變化

CD4:CD4+T細(xì)胞；CD8:CD8+T細(xì)胞；CD4/CD8:CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞

表8 慢性阻塞性肺病急性加重期患者T細(xì)胞及細(xì)胞因子主成分變化

CD4:CD4+T細(xì)胞；CD8:CD8+T細(xì)胞；CD4/CD8:CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞

2.5AECOPD患者T細(xì)胞及細(xì)胞因子與FVC、FEV1.0、FEV1.0/FVC的相關(guān)性 AECOPD患者的FVC、FEV1.0平均水平分別為(2.82±0.62)L、(2.11±0.43)L。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果中，F(xiàn)EV1.0與第一主成分主要變量Th17/Treg、Th17、Treg存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r分別為-0.446(P=0.043)、-0.496(P=0.032)、0.467(P=0.033)；FEV1.0/ FVC與TNF-α和IL-22存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r分別為-0.507(P=0.019)、-0.439(P=0.046)；其余相關(guān)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

COPD的主要病理改變?yōu)橛泻怏w或顆粒導(dǎo)致氣道黏膜的慢性炎癥并持續(xù)發(fā)展，患者持續(xù)出現(xiàn)以咳嗽、咳痰、喘憋等為主要臨床表現(xiàn)的慢性氣管炎或合并伴隨肺氣腫。AECOPD即在穩(wěn)定期COPD患者短期內(nèi)出現(xiàn)上述等癥狀加重、咔膿痰或黏液痰，并伴發(fā)熱等癥狀出現(xiàn)，其發(fā)病原因?？煞譃楦腥竞头歉腥疽蛩?。COPD或AECOPD其病理生理分子機(jī)制仍不清楚。在遺傳易感的基礎(chǔ)上，氣道受到吸煙等釋放的有害物質(zhì)刺激，引發(fā)局部固有免疫防御，進(jìn)而適應(yīng)性免疫應(yīng)答參與其中，在修復(fù)有害物質(zhì)對(duì)氣道黏膜傷害的同時(shí)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并反復(fù)持續(xù)發(fā)生，甚至停止吸煙后仍持續(xù)發(fā)展。大量的研究顯示許多免疫細(xì)胞參與其中，主要有中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及多種細(xì)胞因子。免疫失衡是導(dǎo)致該病持續(xù)發(fā)展的重要病理生理機(jī)制，有學(xué)者提出其中還有自身免疫機(jī)制[9-10]。廣泛的臨床和動(dòng)物模型研究均顯示COPD病程中存在T淋巴細(xì)胞各亞群功能平衡紊亂，普遍觀察到Th17、Treg細(xì)胞平衡紊亂，但存在不一致結(jié)果。有研究顯示COPD病程中Th17細(xì)胞和IL-17表達(dá)增強(qiáng)，Treg降低；也有研究顯示Treg細(xì)胞是升高而非降低，只是升高的幅度不及Th17細(xì)胞；也有學(xué)者認(rèn)為在COPD不同階段，Th17、Treg細(xì)胞平衡變化存在差異[11]。這些結(jié)果提示，COPD與AECOPD發(fā)生發(fā)展中，免疫失衡機(jī)制復(fù)雜，觀察單方面或少數(shù)免疫細(xì)胞的增加或降低，難以找到其內(nèi)在的免疫失衡機(jī)制。為此，本研究從多角度觀察了AECOPD外周血不同功能分類的T淋巴細(xì)胞百分比變化，相關(guān)的細(xì)胞因子變化及它們相互關(guān)系的變化，并通過(guò)因子分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，尋找COPD疾病狀態(tài)下主要免疫失衡機(jī)制。結(jié)果顯示：(1)AECOPD患者外周血中各類T淋巴細(xì)胞水平的變化中，CD8+T細(xì)胞水平較健康對(duì)照人群降低；Treg、Th17細(xì)胞水平較健康對(duì)照人群升高，但Treg升高的幅度不及Th17。(2)細(xì)胞因子層面觀察到AECOPD患者外周血IL-12、IL-22、IL-23、IL-23R和TNF-α水平較健康對(duì)照人群均升高。(3)通過(guò)對(duì)各類T細(xì)胞及細(xì)胞因子間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，AECOPD疾病狀態(tài)下，CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞與Th17、Th17與CD8+T細(xì)胞由負(fù)相關(guān)變?yōu)闊o(wú)相關(guān)；Th17與Treg由正相關(guān)(r=0.403)變?yōu)楦叨蓉?fù)相關(guān)(r=-0.883)；IL-23與CD4+T細(xì)胞、TNF-α與DNT由正相關(guān)變?yōu)闊o(wú)明顯相關(guān)性；IL-22與IL-23由無(wú)相關(guān)性變?yōu)檎嚓P(guān)；其余指標(biāo)之間的相關(guān)性存在相同方向相關(guān)程度的變化。(4)因子分析的結(jié)果顯示，在AECOPD狀態(tài)下，主成分中負(fù)荷變量發(fā)生了諸多變化：健康狀態(tài)時(shí)處于第2主成分的Th17、Treg平衡機(jī)制上升為第1主成分，成為主要的免疫平衡機(jī)制；而健康狀態(tài)時(shí)以CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞平衡為首的機(jī)制退居第2，以IL-12、IL-23R為主要變量的第3主成分退居第4，出現(xiàn)CD4+T細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞為主要變量的第3主成分。以TNF和DNT為主要變量的第5主成分退出主成分，但出現(xiàn)了以IL-23和IL-22為主要變量的第5主成分。(5)T細(xì)胞及細(xì)胞因子與FVC、FEV1.0、FEV1.0/FVC的相關(guān)性顯示，AECOPD患者FEV1.0與Th17呈負(fù)相關(guān)，與Treg呈正相關(guān)；FEV1.0/ FVC與TNF和IL-22呈負(fù)相關(guān)。

以上這些結(jié)果提示：(1)通過(guò)患者外周血中免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的監(jiān)測(cè)，可以觀察到AECOPD狀態(tài)下機(jī)體免疫功能的變化，有助于指導(dǎo)其免疫輔助治療，因此，可以作為COPD的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)指標(biāo)。(2)AECOPD狀態(tài)下，原有的機(jī)體免疫平衡機(jī)制受到破壞，產(chǎn)生了以Th17、Treg變化為主的平衡紊亂：更多的CD4細(xì)胞向Th17極化，促進(jìn)Th17細(xì)胞增多，而具有免疫抑制功能的Treg細(xì)胞增多不到位，并出現(xiàn)負(fù)相關(guān)性改變；IL-12、IL-22、IL-23、IL-23R和TNF-α等細(xì)胞因子均參與其中，但以IL-22與IL-23為主，且IL-23主要促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th17分化與增殖，并分泌IL-22，后者進(jìn)一步誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞集落刺激因子的分泌并促進(jìn)中性粒細(xì)胞的趨化到氣道，加重炎性反應(yīng)和氣道受阻的程度；CD8的細(xì)胞毒作用、DNT的調(diào)節(jié)作用受到弱化。由此可以推測(cè)，COPD病理生理機(jī)制中的主要矛盾可能是：外因引發(fā)的Th17細(xì)胞功能增強(qiáng)超過(guò)抵御外因所致的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致過(guò)度免疫甚至自身免疫。

由于到本院住院救治的COPD患者均為AECOPD患者，本研究中研究對(duì)象主要從住院患者中募集，因此，未能募集到穩(wěn)定期COPD患者，未對(duì)穩(wěn)定期患者進(jìn)行分組對(duì)比分析，上述觀察到的免疫平衡紊亂是否也存在于COPD穩(wěn)定期患者，有待進(jìn)一步觀察。

[1]RABE K F,HURD S,ANZUETO A,et al.Global strategy for the diagnosis,management,and prevention of chronic obstructive pulmonary disease:Gold executive summary[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,176(6):532-555.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組．慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)[J/CD]．中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版)，2014，36(2)：67-79,80．

[3]Raherison C.Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease[J].Nihon Rinsho,2009,38(3):400.

[4]ZHANG J,CHU S,ZHONG X,et al.Increased expression of CD4+IL-17+cells in the lung tissue of patients with stable chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and smokers[J].Int Immunopharmacol,2013,15(1):58-66.

[5]SMYTH L J,STARKEY C,VESTBO J,et al.CD4-regulatory cells in COPD patients[J].Chest,2007,132(1):156-163.

[6]ISAJEVS S,TAIVANS I,STRAZDA G,et al.Decreased FOXP3 expression in small airways of smokers with COPD[J].Eur Respir J,2009,33(1):61-67.

[7]PLUMB J,SMYTH L J,ADAMS H R,et al.Increased T-regulatory cells within lymphocyte follicles in moderate COPD[J].Eur Respir J,2009,34(1):89-94.

[8]WANG H,PENG W,WENG Y,et al.Imbalance of Th17/Treg cells in mice with chronic cigarette smoke exposure[J].Int Immunopharmacol,2012,14(4):504-512.

[9]HONG S C,LEE S H.Role of th17 cell and autoimmunity in chronic obstructive pulmonary disease[J].Immune Netw，2010,10(4):109-114.

[10]ROVINA N,KOUTSOUKOU A,KOULOURIS N G.Inflammation and immune response in COPD:where do we stand[J].Mediators Inflamm,2013,2013(5):1-9.

[11]張?zhí)m英，陳杰，歐陽(yáng)瑤.DCs、Th17及Treg在COPD發(fā)病機(jī)制中作用的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2016,45(7):18-20.