魏晰麟，杜健峰，王 勇，盧佳寧，婁 琳，孫 潔，周忠笑，張 健，曾憲東

(沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院普外三科 110024)

作為消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，結腸癌被認作是腫瘤相關死亡的常見原因之一。持續(xù)積累的基因學及表觀遺傳學失調控與結腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[1]。盡管包括手術、放療、化療在內的多種治療方式均取得了不錯的進展，但結腸癌患者5年生存率依然不高[2]。結腸癌的不佳預后往往認為與其淋巴結轉移和高復發(fā)率密切相關[3]。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一組進化上相對保守的非編碼RNA，其在多種腫瘤中通過調控靶基因的表達而被認為是癌基因或抑癌基因參與到腫瘤的多種生物學行為中[4]。miR-622位于人類基因組13q31.3染色體，并被報道作為抑癌基因參與到包括肝癌、肺癌及膠質瘤等多種惡性腫瘤中[5-7]。目前，關于miR-622在結腸癌中的功能尚有爭議。BALAGUER等[8]通過miRNA芯片研究發(fā)現，相比于癌旁組織，miR-622在結腸癌組織中呈相對高表達。到目前為止，關于miR-622是否可以影響結腸癌侵襲轉移及其具體機制未見報道。

本研究擬在組織學及細胞學水平探討結腸癌中miR-622及雙重特異性酪氨酸調節(jié)激酶2(dual-specificity tyrosine-regulated kinases 2，DYRK2)的表達并進行相關性分析，同時研究miR-622過表達對結腸癌細胞SW1116中DYRK2表達及其侵襲轉移能力的影響。

1 材料與方法

1.1組織細胞來源及主要試劑盒、儀器

1.1.1結腸癌組織標本來源 82例結腸癌及癌旁組織標本均來自2014年2月至2016年2月沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院結腸癌手術過程中切取的新鮮結腸癌組織及相應的癌旁組織，液氮保存運送并置于-80 ℃低溫冰箱保存。術后均經病理學檢查證實診斷為結腸癌，其中男55例，女27例，患者手術前未行放療及化療，年齡42～75歲，平均58歲。

1.1.2細胞來源 結腸癌細胞系SW1116、SW480及正常結腸上皮細胞系NCM460細胞購自中科院上海細胞庫。

1.1.3主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR試劑盒及LipofectamineTM2000轉染試劑盒(美國Invitrogen公司)；SYBR Master Mixture(日本Takara公司)；DYRK2多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；HRP標記的羊抗兔二抗(武漢博士得公司)；miR-622 mimics(miR-622 mimics組)及mimic control(NC組)引物由上海生工生物工程(上海)有限公司合成； Transwell小室(安徽Corning公司)。

1.2結腸癌組織中miR-622、DYRK2的檢測

1.2.1Real-time PCR檢測miR-622、DYRK2 mRNA表達 Trizol提取結腸癌組織及培養(yǎng)的各組細胞總RNA并標記。按照Invitrogen的試劑盒說明書進行反轉錄反應，反應產物行PCR擴增，PCR過程按Invitrogen的SYBR Green 實時熒光定量PCR 試劑盒說明書在熒光定量儀上進行，以U6為miR-622的內參，β-actin為DYRK2的內參。以miR-622與U6拷貝數的比值為其相對表達量，DYRK2與β-actin拷貝數的比值為其相對表達量。miR-622 RT-PCR引物5′-GTC GTA TCC AG T GCG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TGC ACT GGA TAC GAC GCT CCA-3′；miR-622 PCR上游引物5′-GGG ACA GTC TGC TGA GGT-3′，miR-622 PCR下游引物5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；U6上游引物5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，U6下游引物5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；DYRK2上游引物5′-CCT GAA CAA GCA ATGAA GCA-3′； DYRK2下游引物5′-GGT CAT CAT CAT AGC CAC CA-3′；β-actin上游引物5′-AGT GTG ACG TGG ACA TCC GCA AAG-3′，β-actin下游引物5′-ATC CA C ATC TGC TGG AAG G TG GAC-3′。

1.2.2Western blot檢測DYRK2蛋白表達 分別提取組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，取200 μL樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，封閉1 h后，依次行一抗(兔抗人DYRK2和兔抗人β-actin)、二抗(HRP標記的羊抗兔二抗)雜交，最后按增強化學發(fā)光法(ECL)試劑盒說明書行電化學發(fā)光檢測，應用Quantity One軟件行蛋白灰度分析。

1.2.3DYRK2蛋白的免疫組織化學檢測 組織標本取材后，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，依次行石蠟包埋切片、脫蠟復水、抗原修復、封閉、過氧化物酶及1%牛血清清蛋白(BSA)封閉、一抗及二抗孵育、DAB顯色、復染、封片。細胞膜及細胞質呈棕黃色或棕色為陽性。

1.3SW1116、SW480和NCM460細胞中miR-622、DYRK2的檢測 結腸癌細胞系SW1116及SW480細胞及正常結腸上皮細胞系NCM460細胞均培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。定期換液，細胞生長融合至70%～80%時常規(guī)傳代。細胞中的miR-622及DYRK2 mRNA采用Real time PCR法檢測，具體同1.2.1。DYRK2蛋白的檢測用Western blot法，具體同1.2.2。

1.4細胞侵襲轉移能力檢測 選取生長狀態(tài)佳的SW1116細胞，胰酶消化并調整細胞密度為每升2×105個并分組接種于24孔板中，37 ℃、5% CO2孵育24 h，用脂質體轉染法分別轉染50 nmol miR-622 mimics或mimic control。37 ℃孵育6 h，添加500 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，進行后續(xù)檢測。采用Real time PCR法檢測miR-622及DYRK2 mRNA，采用Western blot法檢測DYRK2蛋白。參照Transwell小室說明書，常規(guī)包被底部膜，水化；同步化各組SW1116細胞，調整計數并接種，上室內加入100 μL含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；下室內加入500 μL含20% 胎牛血清的RPMI-1640，37 ℃、5% CO2孵育48 h。取出Transwell小室，棉簽擦去Transwell小室內部細胞，沖洗，固定，染色，倒置顯微鏡下觀察并計數。每組鋪6個Transwell 小室，平均值即細胞侵襲的數量。

2 結 果

2.1結腸癌組織中miR-622和DYRK2的表達及相關性分析 結腸癌組織及癌旁組織配對標本中miR-622和DYRK2 mRNA的表達及DYRK2蛋白的表達見圖 1、2及表1。與癌旁組織比較，Real time PCR和Western blot結果顯示結腸癌組織中DYRK2 mRNA和蛋白呈低表達；免疫組織化學結果顯示，隨著結腸癌臨床分期的增加，DYRK2表達呈明顯降低趨勢。與癌旁組織比較，Real time PCR結果顯示結腸癌組織中miR-622 mRNA表達升高。Pearson相關性分析結果顯示，在結腸癌組織中miR-622與DYRK2表達呈明顯負相關(r=0.916,P<0.05)。此外統(tǒng)計分析發(fā)現miR-622高表達和DYRK2低表達均與結腸癌的淋巴結轉移(P=0.004、0.004)及遠處轉移密切相關(P=0.016、0.010)，見表2。

1：癌旁組織；2：結腸癌組織

圖1結腸癌及癌旁組織配對標本中DYRK2蛋白的Western blot檢測

表1 結腸癌及癌旁組織配對標本中miR-622和DYRK2的表達比較

A:臨床分期Ⅰ期；B：臨床分期Ⅱ期；C：臨床分期Ⅲ期；D：臨床分期Ⅳ期

圖2不同臨床分期結腸癌組織中DYRK2的表達情況(SP×200)

圖3 結腸癌組織中miR-622與DYRK2的表達的相關性分析(R2=0.916)

2.2結腸癌細胞系SW1116、SW480及正常結腸上皮細胞系NCM460中miR-622和DYRK2的表達 結腸癌細胞系SW1116、SW480及正常結腸上皮細胞系NCM460中miR-622和DYRK2的表達情況見圖4、表3。與NCM460比較，SW1116(t=640.00)、SW480(t=954.37)細胞中miR-622 mRNA表達水平明顯升高(均P<0.01)；而DYRK2 mRNA(t=-256.23、-225.18)和蛋白(t=-160.25、-190.87)表達水平明顯降低(均P<0.01)。

表2 結腸癌中miR-622和 DYRK2 的表達與臨床病理參數的相關性分析

2.3miR-622 mimics轉染細胞后miR-622及DYRK2的表達及結腸癌細胞侵襲轉移能力的變化 與NC組比較，miR-622 mimics組SW1116細胞miR-622 mRNA表達上調，DYRK2 mRNA及蛋白表達水平下調，見圖5、表4。進一步的Transwell小室試驗結果提示，NC組穿過小室的細胞數為(75.231±5.350)個，miR-622 mimics組穿過小室的細胞數為(273.45±8.345)個，miR-622 mimics組較NC組明顯增加(t=-136.044，P<0.01)，即細胞的侵襲能力增強。

1：NCM460細胞；2：SW1116細胞；3：SW480細胞

圖4 SW1116、SW480及NCM460細胞系中DYRK2蛋白的Western blot檢測

a:P<0.01,與NCM460比較

1：NC轉染組；2：miR-622 mimics轉染組

圖5 miR-622 mimics轉染SW1116細胞后DYRK2蛋白的Western blot檢測

3 討 論

miRNA是近年來發(fā)現的長約22nt的非編碼RNA，其在腫瘤中的作用主要是作為重要的調節(jié)因子參與到腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中。miR-622在多種腫瘤中均有報道。GUO等[9]報道下調miR-622的表達可促進胃癌細胞侵襲轉移；WANG等[10]報道上調miR-622表達可抑制惡性膠質瘤細胞的增殖、運動與侵襲。而關于miR-622在結腸癌中的功能目前尚存爭議。FANG等[11]報道m(xù)iR-622在結腸癌組織及細胞中表達降低，上調其表達可抑制結腸癌細胞的增殖及轉移能力；而MA等[12]報道m(xù)iR-622在結腸癌中呈高表達，且miR-622的表達增高與結腸癌細胞的放射抵抗和不良預后密切相關。在本研究中，筆者發(fā)現miR-622在結腸癌組織及細胞系SW1116及SW480中呈高表達，筆者通過細胞轉染的方式進一步上調miR-622后發(fā)現上調的miR-622可明顯促進結腸癌細胞SW116的侵襲能力，證實miR-622在結腸癌中起到了癌基因的作用。

DYRK2 隸屬于CMGC蛋白激酶超家族，主要分布于細胞質中，其主要作用被認為與細胞功能的多重效監(jiān)管有關[13]。DYRK2的主要功能是作為GSK3的啟動激酶而存在，DYRK2可直接作用于其底物c-Jun和c-Myc從而參與細胞周期的調控。DYRK2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中同樣起著非常重要的作用。DYRK2在包括乳腺癌、膀胱癌、小細胞肺癌等在內的多種惡性腫瘤中均扮演著抑癌基因的角色[14-17]。DYRK2可通過磷酸化色氨酸從而反應性地增強p53的促凋亡作用[18]。DYRK2在腫瘤中的另一個功能被認為與腫瘤的侵襲轉移密切相關。DYRK2可通過磷酸化其下游的Snail，從而參與Snail介導的腫瘤轉移的關鍵過程——上皮細胞向間充質細胞轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)。本研究的另一個重點即是miR-622對DYRK2表達的影響。研究發(fā)現轉染miR-622 mimics后，miR-622表達水平明顯上調，相應的，DYRK2的mRNA及蛋白表達水平均相應地下調，證實miR-622可負性調控DYRK2的表達。微小RNA功能的實現被認為通過靶向結合于目的mRNA的3′非編碼區(qū)從而在轉錄水平或轉錄后水平引起目的mRNA的降解或影響蛋白質的翻譯。本研究僅僅初步驗證了miR-622對DYRK2的定性調控作用，miR-622能否靶向結合于DYRK2 mRNA的3′非編碼區(qū)并靶向調控其蛋白的表達尚需進一步的LUC基因報告等試驗來驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現結腸癌中miR-622表達升高而DYRK2表達降低，上調miR-622可負性調控DYRK2表達并促進SW1116細胞侵襲轉移，為結腸癌的基因靶向治療提供了新視角。

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