吳明兵，張文鋒，龔建平，苗春木△

(1.重慶兩江新區(qū)第二人民醫(yī)院普外科 401123；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科 400010)

大量的細(xì)胞因子和趨化因子參與了NAFLD的進(jìn)展過(guò)程。Chemerin是一種新近被證實(shí)的參與NAFLD進(jìn)展的趨化蛋白之一[3]。Chemerin還可能通過(guò)調(diào)控膿毒癥患者糖代謝過(guò)程影響患者的生存時(shí)間[4]。此外，LPS可上調(diào)巨噬細(xì)胞表面Chemerin樣受體(chemokine-like receptor 1，CMKLR1)的表達(dá)[5]。因此，Chemerin參與機(jī)體炎性反應(yīng)中代謝紊亂的調(diào)節(jié)。但是，Chemerin是否能誘導(dǎo)KCs激活，以及其在單純非酒精性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎轉(zhuǎn)變過(guò)程中的作用如何，目前鮮有報(bào)道。

最近，磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)抑制劑被報(bào)道具有減少脂肪的功能[6]。但是，PI3K抑制劑是否可通過(guò)減輕KCs誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)緩解NAFLD的進(jìn)展，目前尚不清楚。因此，本研究將利用PI3K抑制劑渥曼青霉素(wortmannin)作用于體外預(yù)先用Chemerin處理的KCs模型，以及腹腔注射NAFLD小鼠模型，通過(guò)KCs介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)相關(guān)蛋白的變化，研究和探討Chemerin參與NAFLD進(jìn)展的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)所用的C57BL/6J小鼠(4周齡，13～15 g，雄性)均購(gòu)買于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠飼養(yǎng)在具有晝夜固定周期的獨(dú)立通風(fēng)籠盒(IVC)動(dòng)物房中，可自由進(jìn)食和飲水。所有與小鼠有關(guān)的操作均得到重慶醫(yī)學(xué)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，以及所有涉及小鼠的操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定。

1.2試劑 LPS(L5293)購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司。渥曼青霉素(S2758)購(gòu)買于美國(guó)Selleck Chemicals公司。Chemerin活性成分Chem157S(SRP6002)和Ⅳ型膠原酶(C5138)購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司。鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(EK0394)、鼠Chemerin ELISA試劑盒 (EK1330)、兔抗β-actin抗體(BM0626)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(BA1050)和RIPA裂解液(AR0102)均購(gòu)買于武漢博士德科技公司。鼠IL-18 ELISA試劑盒(C507380)和基因引物序列均購(gòu)買于上海生工生物科技公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(KGP902)和超敏型ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(KGP1127)均購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)公司。總RNA提取試劑盒(RP5612)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PR6102)和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)試劑盒(PR7702)均購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)公司。兔抗CMKLR1抗體(ab199603)、兔抗炎癥小體3樣受體蛋白(nucleotide oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)抗體(ab214185)購(gòu)買于美國(guó)Abcam公司。兔抗caspase 1 p10(67314)抗體購(gòu)買于美國(guó)CST公司。

1.3方法

1.3.1KCs提取與培養(yǎng) KCs的分離和培養(yǎng)參考課題組LI等[7]的報(bào)道，即C57BL/6J小鼠乙醚吸入麻醉后，常規(guī)備皮、消毒，并逐層剪開皮膚、肌層，以暴露腹腔、肝臟和門靜脈。5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)經(jīng)門靜脈原位灌注肝臟，同時(shí)開放上腔靜脈。然后，游離肝組織，并在0.1%的Ⅳ型膠原酶浸潤(rùn)下離碎肝組織，之后在37 ℃水浴中消化30 min。所得的組織勻漿通過(guò)一個(gè)200目的濾網(wǎng)過(guò)濾，之后利用密度梯度離心法純化。最后，分離得到的細(xì)胞沉渣可繼續(xù)用來(lái)培養(yǎng)，或者提取總蛋白和總RNA。

1.3.2Chemerin和渥曼青霉素體外刺激KCs實(shí)驗(yàn) 關(guān)于Chemerin刺激實(shí)驗(yàn)，即KCs用梯度濃度的Chem157S(0、150、300 ng/mL)處理12 h后，F(xiàn)Q-PCR和蛋白印記法(Wester blot)分別檢測(cè)CMKLR1的mRNA與蛋白表達(dá)水平進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的作用濃度的判斷。關(guān)于渥曼青霉刺激實(shí)驗(yàn)，即KCs用渥曼青霉素(100 nmol/L)預(yù)處理1 h后，再用Chem157S刺激12 h。收集細(xì)胞上清液，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。

1.3.3動(dòng)物分組與處理 20只C57BL/6J小鼠分為4組，每組5只：即標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)組(standard diet group，SD組)，即小鼠每天以正常飼料喂養(yǎng)；單獨(dú)渥曼青霉素處理組(WOR組)，即渥曼青霉素(0.7 g·kg-1·d-1)腹腔注射小鼠12周；高脂飼料飼養(yǎng)組(HFD組)，即小鼠每天以高脂飼料(24%蛋白質(zhì)、41%碳水化合物和24%脂肪)喂養(yǎng)；高脂飼料飼養(yǎng)結(jié)合渥曼青霉素處理組(TRE組)，即小鼠每天喂以高脂飲食，同時(shí)以腹腔注射渥曼青霉素(0.7 g·kg-1·d-1)12周。渥曼青霉素安全有效劑量參考VISSER等[8]的報(bào)道。此外，SD和HFD組小鼠每天以腹腔注射等量的生理鹽水12周作為對(duì)照。各組小鼠均于12周后人道處死：收集小鼠血清以檢測(cè)肝功能和細(xì)胞因子，收集肝組織標(biāo)本以分離KCs和進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。

限定詞是用來(lái)引導(dǎo)名詞的輔助詞類，表達(dá)主有、指示、疑問(wèn)等關(guān)系的詞匯意義。在法語(yǔ)中，限定詞包括冠詞和傳統(tǒng)語(yǔ)法稱為非品質(zhì)形容詞的主有、指示、疑問(wèn)、感嘆、數(shù)目和泛指形容詞。而英語(yǔ)的限定詞則包括定冠詞、不定冠詞、零冠詞以及物主、指示、關(guān)系、疑問(wèn)和不定限定詞等。

1.3.4葡萄糖和胰島素耐量試驗(yàn) 葡萄糖耐量試驗(yàn)，各組小鼠禁食8 h，經(jīng)腹腔注射葡萄糖(1.5 g/kg)。在胰島素耐量試驗(yàn)，即小鼠禁食4 h，腹腔注射胰島素(0.7 IU/kg)。分別在葡萄糖或胰島素注射后0、30、120 min收集小鼠外周靜脈血，利用便攜式血糖儀檢測(cè)血糖水平。

1.3.5ELISA試驗(yàn)和肝功能檢測(cè) 用以檢測(cè)IL-1β和IL-18水平的上清液和血清稀釋20%后，利用市售ELISA試劑盒測(cè)定。用以檢測(cè)Chemerin的血清，其濃度調(diào)整為原液的50%后，利用市售ELISA試劑盒測(cè)定。ELISA檢測(cè)中涉及的所有的操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。小鼠肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)和三酰甘油(triglyceride，TG)由美國(guó)貝克曼全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.3.6FQ-PCR檢測(cè) KCs(1×106)利用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA并測(cè)定濃度后，進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)：即20 μL反應(yīng)體系(1 μg總RNA、10 μL Reverse transcriptase MIX、1 μL FQ-PCR引物和ddH2O)進(jìn)行50 ℃ 5 min，72 ℃ 2 min反應(yīng)。然后，進(jìn)行FQ-PCR：20 μL體系包括10.0 μL 2×Plus SYBR real-time PCR mixture、0.5 μL上游引物(10 μmol/L)、0.5 μL下游引物(10 μmol/L)、1.0 μL cDNA模板、10 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：94.0 ℃,2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃、30 s，進(jìn)行45循環(huán)反應(yīng)。最后，利用公式進(jìn)行定量分析。

2-△△Ct=2-[(Ct目的-Ct內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的-Ct內(nèi)參)]

CMKLR1上游引物序列5′-ATG GAG TAC GAC GCT TAC AAC G-3′，下游引物序列5′-GGT GGC GAT GAC AAT CAC CA-3′，大小為192 bp；GAPDH上游引物序列5′-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3′，下游引物序列5′-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3′，大小為123 bp。

1.3.7Western blot檢測(cè) 用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度并定量。然后，10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)垂直電泳：100 V，120 min。接著進(jìn)行轉(zhuǎn)膜：250 mA，110 min。然后，利用5%脫脂奶粉室溫封閉丙聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h；一抗4 ℃孵育16 h以上；PVDF膜洗滌后，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗室溫孵育1.5 h后，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)法進(jìn)行顯影。蛋白半定量分析，目的條帶灰度值與相應(yīng)β-actin條帶灰度值的比值即為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1Chemerin誘導(dǎo)體外KCs炎癥小體的激活 梯度濃度(0～600 ng/mL)的Chemerin刺激12 h后，體外KCs的CMKLR mRNA和蛋白的表達(dá)水平在隨著Chemerin濃度升高而提高。但當(dāng)Chemerin濃度上升至600 ng/mL時(shí)，CMKLR的mRNA和蛋白的表達(dá)水平將不再升高(圖1A、B)。當(dāng)用300 ng/mL的Chemerin刺激KCs時(shí)，細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18水平明顯高于正常KCs，且NLRP3和caspase 1 p10蛋白表達(dá)水平亦明顯高于正常KCs(圖1C～E)。因此，濃度為300 ng/mL的Chemerin可作為體外刺激KCs而引起炎癥小體激活的適當(dāng)濃度。

A:FQ-PCR分析圖;B、E:Western blot;C、D:ELISA分析圖；a:P<0.05

圖1 Chemerin誘導(dǎo)體外KCs炎癥小體的激活

A:Western blot;B：FQ-PCR分析圖；C、D：ELISA分析圖；a:P<0.05

圖2渥曼青霉素抑制由Chemerin誘導(dǎo)體外KCs炎癥小體的激活

2.2渥曼青霉素抑制由Chemerin誘導(dǎo)體外KCs炎癥小體的激活 利用渥曼青霉素預(yù)處理的Chemerin-KCs，其CMKLR1、NLRP3和caspase 1 p10的mRNA與蛋白的表達(dá)水平均明顯低于單獨(dú)使用Chemerin刺激組，且細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18水平明顯低于單獨(dú)使用Chemerin刺激組(圖2)。因此，渥曼青霉素可抑制由Chemerin誘導(dǎo)體外KCs炎癥小體的激活。

2.3渥曼青霉素緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD HFD組小鼠體質(zhì)量明顯高于SD組，而WOR組小鼠體質(zhì)量明顯低于HFD組，而高于SD組小鼠(圖3A)；HFD組小鼠肝臟指數(shù)明顯低于SD組，WOR組小鼠肝臟指數(shù)明顯高于HFD組，而低于SD組小鼠(圖3B)；HFD組小鼠葡萄糖耐受能力影響低于SD組小鼠，而WOR組小鼠葡萄糖耐受能力明顯高于HFD組，而明顯低于SD組小鼠(圖3C)；HFD組小鼠胰島素耐受能力低于SD組小鼠，而WOR組小鼠胰島素耐受能力明顯高于HFD組，而明顯低于SD組小鼠(圖3D)；HFD組小鼠的ALT、AST、TG和NAS評(píng)分明顯高于SD組小鼠，而WOR組小鼠的ALT、AST、TG和NAS評(píng)分明顯低于HFD組，而明顯高于SD組小鼠(圖3E～H)；HFD組小鼠肝組織脂肪變和炎癥細(xì)胞聚集均明顯多于SD組小鼠，而WOR組小鼠肝組織脂肪變和炎癥細(xì)胞聚集均明顯少于HFD組，明顯多于SD組小鼠(圖3I)；以上變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。利用渥曼青霉治療高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠，可明顯減低小鼠體質(zhì)量、提高肝臟指數(shù)，改善肝功能(ALT、AST和TG)，并且緩解肝組織的脂肪變性、葡萄糖和胰島素抵抗。

A:體質(zhì)量分析；B:肝臟指數(shù)分析；C:小鼠葡萄糖耐受能力分析；D:胰島素耐受能力分析；E:ALT;F:AST;G:TG;H:NAS評(píng)分；I:HE染色;a:P<0.05

圖3渥曼青霉素緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD

A:Western blot;B:FQ-PCR;C～E:ELISA分析結(jié)果圖；a:P<0.05

圖4渥曼青霉素抑制高脂飲食誘導(dǎo)的KCs炎癥小體激活

2.4渥曼青霉素抑制高脂飲食誘導(dǎo)的KCs炎癥小體激活 HFD組小鼠KCs中CMKLR1、NLRP3和caspase 1 p10的蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于SD組，而WOR組小鼠KCs中CMKLR1、NLRP3和caspase 1 p10的蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于HFD組，而高于SD組(圖4A、B)；HFD組小鼠血清中IL-1β和IL-18的水平明顯高于SD組，而WOR組小鼠血清中IL-1β和IL-18的水平明顯低于HFD組，而高于SD組(圖4C、D)；以上變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。利用渥曼青霉治療高脂飲食飼養(yǎng)的小鼠，可明顯抑制KCs中CMKLR1、NLRP3和caspase 1 p10 mRNA與蛋白的表達(dá)，以及降低血清中IL-1β和IL-18水平。見圖4。

3 討 論

本研究利用Chemerin刺激體外KCs，觀察到了CMKLR1表達(dá)升高及NLRP3炎癥小體激活。而PI3K的抑制劑渥曼青霉素可抑制Chemerin誘導(dǎo)的炎癥小體激活。此外，渥曼青霉素還可減輕由高脂飲食誘導(dǎo)的葡萄糖抵抗、胰島素抵抗和肝組織脂肪變。

NAFLD的嚴(yán)重程度與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)，即高脂飲食引起腸道通透性增加，導(dǎo)致腸源性細(xì)菌產(chǎn)物L(fēng)PS等積累引起持續(xù)的、低程度的肝臟炎癥[9]。Chemerin是機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗和NAFLD的危險(xiǎn)因素。據(jù)報(bào)道，Chemerin誘導(dǎo)的葡萄糖代謝紊亂與膿毒癥患者應(yīng)激性高血糖誘發(fā)的病死率密切相關(guān)[4]。因此，Chemerin在NAFLD發(fā)病過(guò)程中可能起到了降低機(jī)體胰島素敏感性和增加肝臟炎癥的作用。此外，肥胖患者的血清Chemerin水平明顯高于正常人群，而進(jìn)行減肥手術(shù)后，Chemerin水平急劇下降[10]。相反，GRUBEN等[11]報(bào)道在敲除CMKLR1不能緩解非酒精性脂肪肝炎的進(jìn)展。然而，本研究的數(shù)據(jù)表明，Chemerin可提高KCs中CMKLR1表達(dá)，以及誘導(dǎo)炎癥小體的激活。此外，Chemerin和CMKLR1在NAFLD小鼠模型均明顯高于正常飼料喂養(yǎng)的小鼠。因此，筆者猜測(cè)，造成本研究結(jié)果與GRUBEN等報(bào)道的結(jié)果不一致的原因可能是飼養(yǎng)小鼠高脂飼料的配方和飼養(yǎng)時(shí)間。

PI3K/Akt通路參與巨噬細(xì)胞的活化、存活和分化的調(diào)節(jié)。而且，PI3K/Akt通路與感染、炎癥、非酒精性脂肪肝等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。PI3K的亞基可誘導(dǎo)Toll樣受體4區(qū)室化，減輕LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)[13]。PI3K抑制劑可減少小鼠的脂肪儲(chǔ)存和降低小鼠體質(zhì)量[6]。同時(shí)，高脂飲食可誘導(dǎo)肝臟KCs中NLRP3炎癥小體激活并增加KCs的炎癥因子分泌[14]。NLRP3炎癥小體通過(guò)激活caspase-1促進(jìn)KC分泌IL-1β和IL-18，從而促進(jìn)NAFLD的進(jìn)展[14]。在本研究中，P13K抑制劑渥曼青霉素可抑制Chemerin誘導(dǎo)體外KCs NLRP3炎癥小體的激活，并且減輕由高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性。這些結(jié)果說(shuō)明，PI3K抑制劑渥曼青霉素通過(guò)下調(diào)KCs的CMKLR1和NLRP3的表達(dá)緩解高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD。然而，本研究結(jié)果并沒有充分的證據(jù)證明CMKLR1/NLRP3信號(hào)通路的存在。假設(shè)CMKLR1/NLRP3通路是確實(shí)存在，這意味著CMKLR1將可能通過(guò)核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)途徑激活下游的NLRP3炎癥小體。但是，BONDUE等[15]已報(bào)道TLR激動(dòng)劑不能改變巨噬細(xì)胞中Chemerin及其受體CMKLR1介導(dǎo)的炎癥因子分泌的水平。因此，本研究結(jié)果尚未建立Chemerin和NLRP3真正的連接機(jī)制，需要在CMKRL1敲除小鼠和NLRP3轉(zhuǎn)基因小鼠上進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，Chemerin可提高KCs中NLRP3和caspase-1 p10的表達(dá)，并促進(jìn)炎癥因子分泌。而PI3K抑制劑渥曼青霉素通過(guò)下調(diào)CMKLR1和NLRP3的表達(dá)，從而抑制Chemerin誘導(dǎo)的炎癥小體激活，以及減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪病變，這些發(fā)現(xiàn)可為NAFLD的防治提供新的思路。

[1]YOUNOSSI Z M,LOOMBA R,RINELLA M E,et al.Current and future therapeutic regimens for non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)and non-alcoholic steatohepatitis(NASH)[J].Hepatology,2017.

[2]LIU Y,ZHANG W F,WU X L,et al.Foxo3a-dependent Bim transcription protects mice from a high fat diet via inhibition of activation of the NLRP3 inflammasome by facilitating autophagy flux in Kupffer cells[J].Oncotarget,2017,8(21):34258-34267.

[3]POHL R,HABERL E M,REIN-FISCHBOECK L,et al.Hepatic chemerin mRNA expression is reduced in human nonalcoholic steatohepatitis[J].Eur J Clin Invest,2017,47(1):7-18.

[4]HORN P,METZING U B,STEIDL R,et al.Chemerin in peritoneal sepsis and its associations with glucose metabolism and prognosis:a translational cross-sectional study[J].Critical Care,2016,20(1):39.

[5]WENG C Y SHEN Z J,LI X B,et al.Effects of chemerin/CMKLR1 in obesity-induced hypertension and potential mechanism[J].Am J Transl Res,2017,9(6):3096-3104.

[6]LOPEZ-GUADAMILLAS E,MUOZMARTIN M,MARTINEZ S,et al.PI3Kα inhibition reduces obesity in mice[J].Aging (Albany NY),2016,8(11):2747-2753.

[7]LI X F,WU Y K,ZHANG W F,et al.Pre-conditioning with tanshinone ⅡA attenuates the ischemia/reperfusion injury caused by liver grafts via regulation of HMGB1 in rat Kupffer cells[J].Biomed Pharmacother,2017,89:1392-1400.

[8]VISSER J G,SMITH C.Development of a transendothelial shuttle by macrophage modification[J].J Tissue Eng Regen Med,2017(14)：1889-1898.

[9]ZHANG W F,WU Y K,MU D,et al.Kupffer cells:increasingly significant role in nonalcoholic fatty liver disease[J].Ann Hepatol,2014,13(5):489-495.

[10]RANGWALA F,GUY C D,LU J Y,et al.Increased production of sonic hedgehog by ballooned hepatocytes[J].J Pathol,2011,224(3):401-410.

[11]GRUBEN N,APARICIO V M,KLOOSTERHUIS N J,et al.Chemokine-like receptor 1 deficiency does not affect the development of insulin resistance and nonalcoholic fatty liver disease in mice[J].PLoS One,2014,9(4):e96345.

[12]ZHOU D X,HUANG C,LIN Z,et al.Macrophage polarization and function with emphasis on the evolving roles of coordinated regulation of cellular signaling pathways[J].Cell Signal,2014,26(2):192-197.

[13]BILANCIO A,RINALDI B,OLIVIERO M A,et al.Inhibition of p110δ PI3K prevents inflammatory response and restenosis after artery injury[J].Biosci Rep,2017,37(5):bsr2017112.

[14]HE K,ZHU X,LIU Y,et al.Inhibition of NLRP3 inflammasome by thioredoxin-interacting protein in mouse Kupffer cells as a regulatory mechanism for non-alcoholic fatty liver disease development[J].Oncotarget,2017,8(23):37657-37672.

[15]BONDUE B,HENAU O D,LUANGSAY S,et al.The chemerin/ChemR23 System does not affect the pro-inflammatory response of mouse and human macrophages ex vivo[J].Plos One,2012,7(6):e40043.